我々は、クロマチンドメインの動的形成を評価するシステムの概要を示す。このシステムを利用して、細胞内でのPRC2媒介クロマチンドメインの採用と普及に追随します。プロセスは、進行中のイベントを分析するためにいつでも一時停止できます。
このシステムは、任意の細胞プロセスの動的変化を監視するために必要とすることができ、したがってクロマチンドメイン形成を追跡することに限定されません。CRISPRデザインツールを使用してマウス胚性幹細胞における胚外胚発生(EED)の内因性コピーのエキソン10と11を削除するガイドRNAを設計することから始めます。原稿の指示に従って、ガイドRNAをCRISPR/Cas9プラスミドにクローンします。
6ウェルプレート形式では、トランスフェクト200,000マウス胚性幹細胞、またはmESCを、メーカーの指示に従ってトランスフェクション試薬を使用して各ガイドRNAのマイクログラムを1マイクログラムずつ使用します。トランスフェクションの24時間後にメディアを交換します。トランスフェクションの2日後、FACSを用いてGFP陽性細胞を単離する。
トランスフェクション効率は約10~30%の範囲で、500,000個の細胞を選別して、めっきに十分なGFP陽性細胞を捕捉します。単離されたGFP陽性細胞を、コロニー摘みのために0.1%ゼラチンで事前にコーティングされた15センチメートルプレートにプレートします。ESC培地中の細胞を、単一のコロニーが見えるまで約1週間増殖させ、2日ごとに培地を変更するようにします。
20マイクロリットルのピペットチップを使用して、20マイクロリットルのピペットチップを使用して、少なくとも48個のコロニーを選び、吸引しながらコロニーを削ります。コロニーを単一細胞に分解することなく、アキュターゼ含有96ウェルプレートに移します。細胞を解約するために10分間摂氏37度でコロニーをインキュベートします。
その後、200マイクロリットルのESCメディアをマルチチャンネルピペットで各井戸に加えます。よく混ぜて、2つの別々の96ウェルプレートに細胞をプレートします。ジェノタイピング用のプレートの一方を使用し、ジェノタイピングが終了するまでもう一方を成長させ続けます。
市販の試薬を使用して、製造業者の指示に従ってプレートからDNAを抽出します。Taq DNAポリメラーゼを用いて遺伝子型化 PCR を実行するために、削除された部位にまたがるジェノタイピングプライマーを使用します。野生型細胞に対してホモ接合欠失を有する細胞内の低分子量のDNA産物を観察する。
CRISPRデザインツールを使用してEEDのエキソン9に続くイントロン内の切り傷を導入し、原稿の指示に従ってCRISPR/Cas9プラスミドにクローン化する設計ガイドRNA。エキソン9後のEED cDNA配列とT2A-GFP配列の上流のC末端Flag-HAタグを含むドナーテンプレートDNAを、内因性遺伝子配列に対して逆向きに設計します。異種反転loxPサイトの間にネストされたスプライスアクセプターとポリアデニエーションシーケンスでカセットを横切り、両端から少なくとも500塩基体の腕を含む。
ドナーテンプレートをgBlocks遺伝子断片の2つのセグメントに分割し、メーカーの指示に従ってギブソンクローニングを使用してPCR Bluntベクターに組み立てます。6ウェルプレート形式では、トランスフェクト200,000 mESCsは、ガイドRNAの1マイクログラムとドナーテンプレートの1マイクログラムを備えています。次にFACSを用いてGFP陽性細胞を単離する。
原稿の方向に従ってジェノタイピングのための個々のコロニーを分離します。フローサイトメトリーを使用して、mESCがGFPの漏れ発現を持たないことを確認し、もしそうであれば、実験を開始する前にFACSによってGFP陰性細胞を単離する。細胞を5つの15センチメートルプレートに拡大し、5マイクロモル4-ヒドロキシタモキシフェンをゼロ時間から8日間の5つの時間の期間に投与することによって野生型またはケージ変異体EEDの発現を誘導する。
それよりも長く続く治療のために12時間後にメディアを変更します。GFPを用いてFACSによって正常に再結合された細胞を単離し、H3K27me2およびH3K27me3に対してChIP-seqを行い、野生型またはケージ変異体EEDの再発現に応答してクロマチンへの時間的沈着を調査する。誘導可能な野生型の救助および誘導可能な突然変異体救助システムを検証するために、ウェスタンブロットは、4-ヒドロキシタモキシフェン処理を用いて野生型またはケージ変異体EEDの誘導後に抽出物全体に対して行われた。
フローサイトメトリー分析は、4-ヒドロキシタモキシフェン処理前後のi-WT-r細胞におけるT2A-GFP発現の効率を確認するために使用され、反転カセットの反転が成功したことを示す。H3K27me3のChIP-seqは、野生型またはケージ変異体EEDの再発現後に行った。H3K27me3の出現は、離散核形成部位で野生型EED発現後12時間、そして初期核形成部位から離れた領域で24時間で観察される。
ChIP-seqはH3K27me3沈着の前に見えるH3K27me2の経時的な沈着を追跡するためにも使用されました。H3K27me3病巣およびそれらの成長はまた蛍光顕微鏡で視覚化された。野生型EED発現の12時間後、H3K27me3病巣形成の証拠がある。
これらの病巣は数とサイズが24時間増加し、最終的には核の大きな領域に36時間広がった。DNA構築物の正確な設計は、望ましい誘導可能な救助システムを生成するために非常に重要です。この方法は、マウスにおけるタンパク質の変異を時間的かつ特別に制御することができる。
このようにして、特定の組織または特定の発達段階における突然変異の影響を決定することができる。我々は現在、別のクロマチンドメイン、ポリコム抑制複合体1の動的確立を監視するためにこのシステムを使用しています。
