Wir skizzieren ein System zur Bewertung der dynamischen Bildung von Chromatin-Domänen. Wir nutzen dieses System, um die Rekrutierung und Verbreitung von PRC2-vermittelten Chromatin-Domänen in Zellen zu verfolgen. Der Prozess kann jederzeit angehalten werden, um die laufenden Ereignisse zu analysieren.
Dieses System könnte darauf ausgerichtet sein, dynamische Veränderungen in einem bestimmten zellulären Prozess zu überwachen und ist daher nicht auf die Verfolgung der Bildung von Chromatin-Domänen beschränkt. Beginnen Sie mit dem Entwurf von Guide RNAs, um Exon 10 und 11 einer endogenen Kopie der embryonalen Ektodermentwicklung (EED) in embryonalen Stammzellen der Maus mit dem CRISPR Design Tool zu löschen. Klonen Sie die Guide RNAs in das CRISPR/Cas9-Plasmid gemäß Manuskriptanweisungen.
In einem Sechs-Well-Plattenformat transfekt 200 000 mausembryonale Stammzellen oder mESCs mit einem Mikrogramm jeder Führungs-RNA mit Transfektionsreagenzien gemäß herstellerspezifischen Anweisungen. Wechseln Sie das Medium 24 Stunden nach der Transfektion. Zwei Tage nach der Transfektion gfP-positive Zellen mit FACS isolieren.
Die Transfektionseffizienz reicht von etwa 10 bis 30%, also sortieren Sie etwa 500.000 Zellen, um genügend GFP-positive Zellen für die Beschichtung zu erfassen. Die isolierten GFP-positiven Zellen in 15-Zentimeter-Platten vorschichten, die mit 0,1% Gelatine für die Koloniepfierung vorbeschichtet sind. Wachsen Sie die Zellen im ESC-Medium für etwa eine Woche, bis einzelne Kolonien sichtbar sind, und stellen Sie sicher, dass die Medien alle zwei Tage wechseln.
Wählen Sie mindestens 48 Kolonien, indem Sie eine 20-Mikroliter-Pipettenspitze verwenden, um während des Ansaischens über die Kolonie zu kratzen. Ohne die Kolonie in einzelne Zellen aufzuteilen, übertragen Sie sie auf eine Accutase-haltige 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Kolonien bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten, um die Zellen zu dissoziieren.
Dann fügen Sie 200 Mikroliter ESC-Medien zu jedem Brunnen mit einer Mehrkanalpipette. Gut mischen und die Zellen in zwei separate 96-Well-Platten unterteilen. Verwenden Sie eine der Platten für die Genotypisierung, und halten Sie die andere wachsen, bis genotypisieren abgeschlossen ist.
Extrahieren Sie DNA aus der Platte mit kommerziellen Reagenzien und nach den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie Genotypisierungsprimer, die die gelöschte Seite überspannen, um genotypisierende PCR mit Taq-DNA-Polymerase durchzuführen. Beobachten Sie ein DNA-Produkt mit geringerem Molekulargewicht in Zellen mit einer homozygoten Deletion relativ zu den Wildtypzellen.
Design-Leitfaden-RNA, um einen Schnitt innerhalb des Introns nach Exon 9 von EED mit einem CRISPR Design Tool einzuführen und ihn gemäß Manuskriptanweisungen in das CRISPR/Cas9-Plasmid zu klonen. Entwerfen Sie eine Spender-Vorlagen-DNA, die die EED-cDNA-Sequenz nach Exon 9 und ein C-terminales Flag-HA-Tag vor einer T2A-GFP-Sequenz enthält, alles in umgekehrter Ausrichtung in Bezug auf die endogene Gensequenz. Flankieren Sie die Kassette mit einem Spleiß-Akzeptor und einer Polyadenylierungssequenz, die zwischen heterologen invertierten LoxP-Standorten verschachtelt ist, und schließen Sie mindestens 500 Basispaare von Homologiearmen von jedem Ende ein.
Teilen Sie die Spendervorlage in zwei Segmente von gBlocks Gene Fragments auf und montieren Sie sie mithilfe des Gibson-Klonens gemäß den Anweisungen des Herstellers in einen PCR Blunt-Vektor. In einem Sechs-Well-Plattenformat transfekt man 200 000 mESCs mit einem Mikrogramm der Führungs-RNA und einem Mikrogramm der Spendervorlagen. Isolieren Sie dann GFP-positive Zellen mit FACS.
Isolieren Sie einzelne Kolonien für die Genotypisierung nach Manuskriptrichtungen. Verwenden Sie die Durchflusszytometrie, um zu bestätigen, dass die mESCs keine undichte Expression von GFP haben, und isolieren Sie, falls dies der Fall ist, GFP-negative Zellen durch FACS, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Erweitern Sie die Zellen in fünf 15-Zentimeter-Platten und induzieren Sie die Expression von Wildtyp oder Käfig-mutiertem EED, indem Sie 5-Mikromolar 4-Hydroxytamoxifen für fünf verschiedene Zeitdauern von null Stunden bis zu acht Tagen verabreichen.
Wechseln Sie die Medien nach 12 Stunden für Behandlungen, die länger als das dauern. Isolieren Sie die erfolgreich rekombinierten Zellen durch FACS mit GFP, und führen Sie ChIP-seq für H3K27me2 und H3K27me3 durch, um ihre zeitliche Ablagerung an Chromatin als Reaktion auf die Wiederexpression ungezügelter oder käfigmutierter EED zu untersuchen. Zur Validierung der induzierbaren Wildtyp-Rettungs- und induzierbaren mutierten Rettungssysteme wurde westlicher Blot nach Induktion von Wildtyp- oder Käfigmutanten EED mit 4-Hydroxytamoxifen-Behandlung an ganzen Extrakten durchgeführt.
Die Durchflusszytometrie-Analyse wurde verwendet, um die Effizienz der T2A-GFP-Expression in i-WT-r-Zellen vor und nach der 4-Hydroxytamoxifen-Behandlung zu bestätigen, was das erfolgreiche Flip der invertierten Kassette demonstriert. ChIP-seq von H3K27me3 wurde nach Wiederexpression von Wildtyp oder Käfig-mutant EED durchgeführt. Die Entstehung von H3K27me3 wird 12 Stunden nach der Wilden-Typ-EED-Expression an diskreten Keimbildungsstellen und dann 24 Stunden in Regionen beobachtet, die von den ursprünglichen Keimbildungsstätten entfernt sind.
ChIP-seq wurde auch verwendet, um die zeitliche Ablagerung von H3K27me2 zu verfolgen, die H3K27me3 Ablagerung vorausgehen scheint. Die H3K27me3-Schwerpunkte und ihr Wachstum wurden ebenfalls mit Fluoreszenzmikroskopie visualisiert. Nach 12 Stunden Wildtyp EED-Expression gibt es Hinweise auf H3K27me3 Foci Bildung.
Diese Brennpunkte nehmen um 24 Stunden zu und breiten sich schließlich um 36 Stunden auf große Regionen des Kerns aus. Die genaue Konstruktion von DNA-Konstrukten ist sehr wichtig, um das gewünschte induzierbare Rettungssystem zu erzeugen. Diese Methode kann eine zeitliche und spezielle Kontrolle von Mutationen von Proteinen bei Mäusen bieten.
Auf diese Weise könnte man die Wirkung von Mutationen in einem bestimmten Gewebe oder in einem bestimmten Entwicklungsstadium bestimmen. Wir verwenden derzeit dieses System, um die dynamische Etablierung einer anderen Chromatin-Domäne zu überwachen, Polycomb repressiven Komplex 1.
