Nous décrivons un système pour évaluer la formation dynamique des domaines de chromatine. Nous utilisons ce système pour suivre le recrutement et la diffusion des domaines de chromatine prc2-2 dans les cellules. Le processus peut être interrompu à tout moment pour analyser les événements en cours.
Ce système pourrait être orienté pour surveiller les changements dynamiques dans n’importe quel processus cellulaire donné et ne se limite donc pas au suivi de la formation de domaine chromatine. Commencez par concevoir des ARN guides pour supprimer les exon 10 et 11 d’une copie endogène du développement embryonnaire de l’ectoderme, ou EED, dans les cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de l’outil de conception CRISPR. Cloner le guide ARN dans le plasmide CRISPR/Cas9 selon les instructions manuscrites.
Dans un format de plaques de six puits, transfect 200.000 cellules souches embryonnaires de souris, ou mESCs, avec un microgramme de chaque ARN guide en utilisant des réadiants transfection selon les instructions du fabricant. Changez les médias 24 heures après la transfection. Deux jours après la transfection, isoler les cellules GFP-positives à l’aide de FACS.
L’efficacité de la transfection varie d’environ 10 à 30%, donc triez environ 500 000 cellules pour capturer suffisamment de cellules GFP positives pour le placage. Plaquez les cellules gfp-positives isolées en plaques de 15 centimètres qui sont pré-enduites de gélatine de 0,1 % pour la cueillette des colonies. Faire croître les cellules dans le milieu ESC pendant environ une semaine jusqu’à ce que les colonies simples soient visibles, en s’assurant de changer les médias tous les deux jours.
Choisissez un minimum de 48 colonies à l’aide d’une pointe de pipette de 20 microlitres pour gratter la colonie pendant l’aspiration. Sans décomposer la colonie en cellules individuelles, transférez-la dans une plaque contenant 96 puits contenant de l’Accutase. Incuber les colonies à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes pour dissocier les cellules.
Ajoutez ensuite 200 microlitres de supports ESC à chaque puits avec une pipette multicanal. Bien mélanger et plaquer les cellules en deux plaques séparées de 96 puits. Utilisez l’une des plaques pour le génotypage et gardez l’autre en croissance jusqu’à ce que le génotypage soit terminé.
Extraire l’ADN de la plaque à l’aide de reagents commerciaux et suivre les instructions du fabricant. Utilisez des amorces génotypage qui couvrent le site supprimé pour effectuer le génotypage PCR avec polymése d’ADN Taq. Observez un produit d’ADN de poids moléculaire inférieur dans les cellules avec une suppression d’homozygote par rapport aux cellules sauvages-type.
Guide de conception ARN pour introduire une coupe dans l’intron suivant l’exon 9 de l’EED à l’aide d’un outil de conception CRISPR, et le cloner dans le plasmide CRISPR/Cas9 selon les instructions manuscrites. Concevoir un modèle d’ADN donneur qui inclut la séquence EED cDNA après l’exon 9 et une étiquette Flag-HA en amont d’une séquence T2A-GFP, le tout en orientation inverse par rapport à la séquence du gène endogène. Flanquez la cassette d’un épissage-accepteur et d’une séquence de polyadenylation nichée entre des sites de loxP inversés héterologiques, et incluez au moins 500 paires de base d’armes homologiques de chaque extrémité.
Divisez le modèle de donneur en deux segments de fragments de gènes gBlocks et assemblez-les en un vecteur PCR Blunt à l’aide du clonage Gibson suivant les instructions du fabricant. Dans un format de plaques de six puits, transfect 200.000 mESCs avec un microgramme de l’ARN guide et un microgramme des modèles donneurs. Puis isoler les cellules GFP-positives à l’aide de FACS.
Isoler les colonies individuelles pour le génotypage selon les instructions manuscrites. Utilisez la cytométrie du débit pour confirmer que les MESC n’ont pas d’expression qui fuit du GFP et, si c’est le cas, isolez les cellules gfp-négatives par FACS avant de commencer l’expérience. Étendre les cellules en cinq plaques de 15 centimètres, et induire l’expression de type sauvage ou cage mutant EED en administrant 5 micromolaires 4-hydroxytamoxifène pour cinq durées différentes allant de zéro heures à huit jours.
Changez les médias après 12 heures pour des traitements qui durent plus longtemps que cela. Isoler les cellules recombinées avec succès par FACS à l’aide de GFP, et effectuer ChIP-seq pour H3K27me2 et H3K27me3 pour étudier leur dépôt temporel à la chromatine en réponse à la ré-expression de type sauvage ou cage mutant EED. Pour valider le sauvetage inducible de type sauvage et les systèmes de sauvetage mutants inductibles, la tache occidentale a été exécutée sur des extraits entiers après l’induction de l’EED sauvage-type ou cage-mutant avec le traitement de 4 hydroxytamoxifène.
L’analyse de cytométrie de flux a été employée pour confirmer l’efficacité de l’expression de T2A-GFP dans les cellules d’i-WT-r avant et après le traitement de 4-hydroxytamoxifen, qui démontre le flip réussi de la cassette inversée. ChIP-seq de H3K27me3 a été exécuté après ré-expression de type sauvage ou cage-mutant EED. L’émergence du H3K27me3 est observée 12 heures après l’expression de l’EED de type sauvage sur des sites de nucléation discrets, puis à 24 heures dans des régions éloignées des sites de nucléation initiaux.
ChIP-seq a également été utilisé pour suivre le dépôt temporel de H3K27me2, qui semble précéder le dépôt H3K27me3. Les foyers H3K27me3 et leur croissance ont également été visualisés par microscopie fluorescence. Après 12 heures d’expression eED de type sauvage, il existe des preuves de formation de foyers H3K27me3.
Ces foyers augmentent en nombre et en taille de 24 heures et finissent par se propager à de grandes régions du noyau de 36 heures. La conception précise des constructions d’ADN est très importante pour générer le système de sauvetage inductible désiré. Cette méthode peut fournir un contrôle temporel et spécial des mutations des protéines chez la souris.
De cette façon, on pourrait déterminer l’effet des mutations dans un tissu spécifique ou à un stade spécifique de développement. Nous utilisons actuellement ce système pour surveiller l’établissement dynamique d’un autre domaine chromatine, polycomb complexe répressif 1.
