Delineamos un sistema para evaluar la formación dinámica de dominios de cromatina. Utilizamos este sistema para seguir el reclutamiento y la difusión de dominios de cromatina mediados por PRC2 en las células. El proceso se puede pausar en cualquier momento para analizar los eventos en curso.
Este sistema podría estar orientado a monitorear los cambios dinámicos en cualquier proceso celular dado y por lo tanto no se limita al seguimiento de la formación del dominio de la cromatina. Comience por diseñar ARN guía para eliminar los exón 10 y 11 de una copia endógena del desarrollo de ectodermo embrionario, o EED, en células madre embrionarias de ratón utilizando la herramienta de diseño CRISPR. Clonar los ARN guía en el plásmido CRISPR/Cas9 de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
En un formato de placa de seis pocillos, transfectar 200.000 células madre embrionarias de ratón, o mESC, con un microgramo de cada ARN guía utilizando reactivos de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cambie los medios 24 horas después de la transfección. Dos días después de la transfección, aísle las células GFP positivas usando FACS.
La eficiencia de la transfección oscila entre un 10 y un 30%, por lo que se clasifican alrededor de 500.000 células para capturar suficientes células GFP positivas para el chapado. Plato de las células aisladas GFP positivos en placas de 15 centímetros que están pre-recubiertas con 0.1%gelatina para la recolección de colonias. Crecer las células en el medio ESC durante aproximadamente una semana hasta que las colonias individuales sean visibles, asegurándose de cambiar los medios cada dos días.
Elige un mínimo de 48 colonias usando una punta de pipeta de 20 microlitros para raspar la colonia mientras aspiras. Sin dividir la colonia en células individuales, transfiérala a una placa de 96 pozos que contiene Accutase. Incubar las colonias a 37 grados centígrados durante 10 minutos para disociar las células.
A continuación, añada 200 microlitros de medios ESC a cada pozo con una pipeta multicanal. Mezcle bien y culte las células en dos placas separadas de 96 pozos. Utilice una de las placas para el genotipado y mantenga la otra creciendo hasta que se concluya el genotipado.
Extraiga ADN de la placa utilizando reactivos comerciales y siguiendo las instrucciones del fabricante. Utilice imprimaciones de genotipado que abarquen el sitio eliminado para realizar la PCR genotipado con la polimerasa de ADN Taq. Observar un producto de ADN de menor peso molecular en células con una deleción homocigota en relación con las células de tipo salvaje.
Diseñe el ARN guía para introducir un corte dentro del intrón siguiente de EED utilizando una herramienta de diseño CRISPR, y clone en el plásmido CRISPR/Cas9 de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Diseñe un ADN de plantilla de donante que incluya la secuencia EED cDNA después del exón 9 y una etiqueta C-terminal Flag-HA aguas arriba de una secuencia T2A-GFP, todo en orientación inversa con respecto a la secuencia genética endógena. Flanquee el casete con un aceptador de empalmes y una secuencia de poliadenilación anidada entre sitios loxP invertidos heterólogos, e incluya al menos 500 pares base de brazos homológicos de cada extremo.
Divida la plantilla de donante en dos segmentos de gBlocks Gene Fragments y ensébloquelos en un vector PCR Blunt utilizando la clonación de Gibson siguiendo las instrucciones del fabricante. En un formato de placa de seis pozos, transfectar 200.000 mESC con un microgramo del ARN guía y un microgramo de las plantillas de donante. A continuación, aísle las células positivas de GFP mediante FACS.
Aísle las colonias individuales para el genotipado de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Utilice la citometría de flujo para confirmar que los mESC no tienen una expresión con fugas de GFP y, si lo hacen, aíslen las células negativas de la GFP por FACS antes de iniciar el experimento. Expanda las células en cinco placas de 15 centímetros e induzca la expresión de EED de tipo salvaje o mutante de jaula mediante la administración de 5 micromolares 4-hidroxitamoxifeno durante cinco duraciones de tiempo diferentes que van desde cero horas hasta ocho días.
Cambie los medios después de 12 horas para los tratamientos que duran más que eso. Aísle las células recombinadas con éxito por FACS utilizando GFP, y realice ChIP-seq para H3K27me2 y H3K27me3 para investigar su deposición temporal a la cromatina en respuesta a la expresión de EED mutante de jaula salvaje o mutante de jaula. Para validar el rescate inducible de tipo salvaje y los sistemas de rescate mutante inducible, western blot se realizó en extractos enteros después de la inducción de EED de tipo salvaje o mutante de jaula con tratamiento de 4-hidroxitamoxifeno.
El análisis de citometría de flujo se utilizó para confirmar la eficiencia de la expresión T2A-GFP en células i-WT-r antes y después del tratamiento con 4-hidroxitamoxifeno, lo que demuestra el volteo exitoso del casete invertido. ChIP-seq de H3K27me3 se realizó después de la reexpresión de EED de tipo salvaje o mutante de jaula. La aparición de H3K27me3 se observa a las 12 horas después de la expresión de EED de tipo salvaje en sitios de nucleación discretos y luego a las 24 horas en regiones distantes de los sitios iniciales de nucleación.
ChIP-seq también se utilizó para rastrear la deposición temporal de H3K27me2, que parece preceder a la deposición H3K27me3. Los focos H3K27me3 y su crecimiento también se han visualizado con microscopía de fluorescencia. Después de 12 horas de expresión EED de tipo salvaje, hay evidencia de formación de focos H3K27me3.
Estos focos aumentan en número y tamaño en 24 horas y finalmente se propagan a grandes regiones del núcleo por 36 horas. El diseño preciso de las construcciones de ADN es muy importante para generar el sistema de rescate inducible deseado. Este método puede proporcionar un control temporal y especial de mutaciones de proteínas en ratones.
De esta manera, se podría determinar el efecto de las mutaciones en un tejido específico o en una etapa específica de desarrollo. Actualmente estamos utilizando este sistema para monitorear el establecimiento dinámico de otro dominio de cromatina, Polycomb complejo represivo 1.
