Delineamo un sistema per valutare la formazione dinamica dei domini di cromatina. Utilizziamo questo sistema per seguire il reclutamento e la diffusione di domini di cromatina mediati da PRC2 nelle cellule. Il processo può essere messo in pausa in qualsiasi momento per analizzare gli eventi in corso.
Questo sistema potrebbe essere orientato a monitorare i cambiamenti dinamici in un dato processo cellulare e quindi non si limita a tracciare la formazione di dominio di cromatina. Inizia progettando RNA guida per eliminare l'esone 10 e 11 di una copia endogena dello sviluppo di ectoderma embrionale, o EED, nelle cellule staminali embrionali del topo utilizzando crispr design tool. Clonare gli RNA guida nel plasmide CRISPR/Cas9 secondo le indicazioni manoscritte.
In un formato a piastre a sei pozzetti, trasfettare 200.000 cellule staminali embrionali di topo, o mESC, con un microgrammo di ogni RNA guida utilizzando reagenti di trasfezione secondo le istruzioni del produttore. Cambiare il supporto 24 ore dopo la trasfezione. Due giorni dopo la trasfezione, isolare le cellule positive alla GFP utilizzando FACS.
L'efficienza di trasfezione varia da circa il 10 al 30%, quindi ordina circa 500.000 celle per catturare celle positive alla GFP sufficienti per la placcatura. Placcare le cellule isolate positive alla GFP in piastre di 15 centimetri pre-rivestite con gelatina allo 0,1% per la raccolta delle colonie. Far crescere le cellule nel mezzo ESC per circa una settimana fino a quando non sono visibili singole colonie, assicurandosi di cambiare i supporti ogni due giorni.
Scegli un minimo di 48 colonie usando una punta di pipetta da 20 microliter per raschiare la colonia durante l'aspirazione. Senza suddividere la colonia in singole cellule, trasferirla su una piastra di 96 pozzi contenente Accutasi. Incubare le colonie a 37 gradi Celsius per 10 minuti per dissociare le cellule.
Quindi aggiungere 200 microlitri di supporti ESC a ciascun pozzo con una pipetta multicanale. Mescolare bene e placcare le celle in due piastre separate da 96 pozzi. Utilizzare una delle piastre per la genotipizzazione e mantenere l'altra in crescita fino alla conclusione del genotipizzazione.
Estrarre il DNA dalla piastra utilizzando reagenti commerciali e seguendo le indicazioni del produttore. Utilizzare primer di genotipizzazione che si estendono sul sito eliminato per eseguire la genotipizzazione della PCR con Taq DNA polimerasi. Osservare un prodotto di DNA di minor peso molecolare nelle cellule con una cancellazione omozigota rispetto alle cellule di tipo selvatico.
Guida al design RNA per introdurre un taglio all'interno dell'introne dopo l'esone 9 di EED utilizzando uno strumento di progettazione CRISPR e clonarlo nel plasmide CRISPR / Cas9 secondo le indicazioni del manoscritto. Progettare un DNA modello donatore che includa la sequenza CDNA EED dopo l'esone 9 e un tag Flag-HA del terminale C a monte di una sequenza T2A-GFP, il tutto in orientamento inverso rispetto alla sequenza genica endogena. Fiancheggia la cassetta con un accettore di giunzione e una sequenza di poliadenilazione annidata tra siti loxP invertiti eterologa, e includi almeno 500 coppie di basi di bracci di omologia da ogni estremità.
Dividi il modello donatore in due segmenti di frammenti genetici gBlocks e assemblali in un vettore SMussato PCR usando la clonazione Gibson seguendo le istruzioni del produttore. In formato piastra a sei pozze di pozzo, trasfetto 200.000 mESC con un microgrammo dell'RNA guida e un microgrammo dei modelli donatori. Quindi isolare le cellule positive alla GFP utilizzando FACS.
Isolare le singole colonie per la genotipizzazione secondo le indicazioni manoscritte. Utilizzare la citometria del flusso per confermare che gli mESC non hanno espressione perdente di GFP e, in tal caso, isolare le cellule GFP negative da FACS prima di iniziare l'esperimento. Espandere le cellule in cinque piastre di 15 centimetri e indurre l'espressione di EED mutante di tipo selvaggio o gabbia somministrando 4-idrossitamoxifene 5-micromolare per cinque diverse durate di tempo che vanno da zero ore a otto giorni.
Cambiare il supporto dopo 12 ore per trattamenti che durano più a lungo. Isolare le cellule ricombinate con successo da FACS utilizzando GFP ed eseguire ChIP-seq per H3K27me2 e H3K27me3 per indagare la loro deposizione temporale alla cromatina in risposta alla ri-espressione di EED di tipo selvaggio o mutante in gabbia. Per convalidare i sistemi di salvataggio indutbili di tipo selvatico e di salvataggio mutante inducibile, la macchia occidentale è stata eseguita su estratti interi dopo l'induzione di EED di tipo selvatico o mutante in gabbia con trattamento con 4-idrossitamoxifene.
L'analisi della citometria a flusso è stata utilizzata per confermare l'efficienza dell'espressione T2A-GFP nelle cellule i-WT-r prima e dopo il trattamento con 4-idrossitamoxifene, il che dimostra il successo del lancio della cassetta invertita. ChIP-seq di H3K27me3 è stato eseguito dopo la ri-espressione di EED wild-type o cage-mutant. L'emergere di H3K27me3 si osserva a 12 ore dopo l'espressione EED di tipo selvaggio in siti di nucleazione discreti e poi a 24 ore in regioni distanti dai siti di nucleazione iniziali.
ChIP-seq è stato anche usato per tracciare la deposizione temporale di H3K27me2, che sembra precedere la deposizione di H3K27me3. Anche i focolai H3K27me3 e la loro crescita sono stati visualizzati con microscopia a fluorescenza. Dopo 12 ore di espressione EED di tipo selvaggio, ci sono prove della formazione di focolai H3K27me3.
Questi focolai aumentano di 24 ore di numero e dimensioni e alla fine si diffondono in grandi regioni del nucleo di 36 ore. Il design accurato dei costrutti di DNA è molto importante per generare il sistema di salvataggio induttibile desiderato. Questo metodo può fornire un controllo temporale e speciale delle mutazioni delle proteine nei topi.
In questo modo, si potrebbe determinare l'effetto delle mutazioni in un tessuto specifico o in uno stadio specifico di sviluppo. Attualmente stiamo utilizzando questo sistema per monitorare la creazione dinamica di un altro dominio di cromatina, il complesso repressivo Polycomb 1.
