Delineamos um sistema para avaliar a formação dinâmica dos domínios da cromatina. Utilizamos este sistema para acompanhar o recrutamento e a disseminação de domínios de cromatina mediada pela PRC2 em células. O processo pode ser pausado a qualquer momento para analisar os eventos em andamento.
Este sistema poderia ser orientado para monitorar mudanças dinâmicas em qualquer processo celular e, portanto, não se limita ao rastreamento da formação de domínios de cromatina. Comece projetando rnAs guia para excluir exon 10 e 11 de uma cópia endógena do desenvolvimento de ectoderme embrionário, ou EED, em células-tronco embrionárias do mouse usando a Ferramenta de Design CRISPR. Clone o guia RNAs no plasmídeo CRISPR/Cas9 de acordo com as instruções do manuscrito.
Em um formato de placa de seis poços, transfem 200.000 células-tronco embrionárias de camundongos, ou mESCs, com um micrograma de cada RNA guia usando reagentes de transfecção de acordo com as instruções do fabricante. Mude a mídia 24 horas após a transfecção. Dois dias após a transfecção, isole as células GFP-positive usando FACS.
A eficiência da transfecção varia de cerca de 10 a 30%, então classifique cerca de 500.000 células para capturar células positivas de GFP suficientes para chapeamento. Aplaque as células isoladas GFP-positive em placas de 15 centímetros que são pré-revestidas com gelatina de 0,1% para colheita de colônias. Cresça as células no meio ESC por cerca de uma semana até que colônias únicas sejam visíveis, certificando-se de mudar a mídia a cada dois dias.
Escolha um mínimo de 48 colônias usando uma ponta de pipeta de 20 microliter para raspar sobre a colônia enquanto aspira. Sem quebrar a colônia em células únicas, transfira-a para uma placa de 96 poços contendo Accutase. Incubar as colônias a 37 graus Celsius por 10 minutos para dissociar as células.
Em seguida, adicione 200 microliters de mídia ESC a cada poço com uma pipeta multicanal. Misture bem e coloque as células em duas placas separadas de 96 poços. Use uma das placas para genotipagem, e mantenha a outra crescendo até que a genotipagem seja concluída.
Extrair DNA da placa usando reagentes comerciais e seguindo as instruções do fabricante. Use primers genotipagem que abrangem o local excluído para executar pcr genotipagem com polimerase de DNA Taq. Observe um produto de DNA de menor peso molecular nas células com uma exclusão homozigosa em relação às células do tipo selvagem.
Design guia RNA para introduzir um corte dentro do intron seguinte exon 9 de EED usando uma ferramenta de design CRISPR, e cloná-lo no plasmídeo CRISPR/Cas9 de acordo com as instruções do manuscrito. Projete um DNA de modelo de doador que inclua a sequência de EED cDNA após o exon 9 e uma tag C-terminal Flag-HA a montante de uma sequência T2A-GFP, tudo em orientação reversa em relação à sequência genética endógena. Flanquear o com um aceitador de emendas e uma sequência de poliadenilação aninhada entre locais heterologos invertidos de loxP, e inclua pelo menos 500 pares de bases de braços de escoologia de cada extremidade.
Divida o modelo de doador em dois segmentos de gBlocks Gene Fragments e monte-os em um vetor PCR Blunt usando clonagem Gibson seguindo as instruções do fabricante. Em formato de placa de seis poços, transfeto 200.000 mESCs com um micrograma do RNA guia e um micrograma dos modelos doadores. Em seguida, isole as células GFP positivos usando FACS.
Isole colônias individuais para genotipagem de acordo com as instruções do manuscrito. Use a citometria de fluxo para confirmar que os mESCs não têm expressão vazada de GFP e, se o fizerem, isole células GFP-negativas pelo FACS antes de iniciar o experimento. Expanda as células em cinco placas de 15 centímetros, e induza a expressão de EED do tipo selvagem ou mutante da gaiola, administrando 5 micromolar 4-hidroxitamoxifen por cinco durações de tempo diferentes que variam de zero horas a oito dias.
Mude a mídia após 12 horas para tratamentos que duram mais do que isso. Isole as células recombinadas com sucesso pela FACS usando GFP, e execute ChIP-seq para H3K27me2 e H3K27me3 para investigar sua deposição temporal para cromatina em resposta à reexpressão do EED tipo selvagem ou mutante da gaiola. Para validar os sistemas induíveis de resgate selvagem e de resgate de mutantes induíveis, a mancha ocidental foi realizada em extratos inteiros após a indução de EED tipo selvagem ou mutante de gaiola com tratamento de 4-hidroximoxifen.
A análise da citometria de fluxo foi utilizada para confirmar a eficiência da expressão T2A-GFP em células i-WT-r antes e depois do tratamento 4-hidroxytamoxifen, o que demonstra a virada bem sucedida do invertido. ChIP-seq de H3K27me3 foi realizado após reexpressão de EED tipo selvagem ou mutante de gaiola. O surgimento de H3K27me3 é observado às 12 horas após a expressão EED do tipo selvagem em locais de nucleação discretos e, em seguida, em 24 horas em regiões distantes dos locais de nucleação inicial.
ChIP-seq também foi usado para rastrear a deposição temporal de H3K27me2, que parece preceder o depoimento de H3K27me3. Os focos H3K27me3 e seu crescimento também foram visualizados com microscopia de fluorescência. Após 12 horas de expressão EED tipo selvagem, há evidências da formação de focos H3K27me3.
Esses focos aumentam em número e tamanho em 24 horas e eventualmente se espalham para grandes regiões do núcleo em 36 horas. O desenho preciso das construções de DNA é muito importante para gerar o sistema de resgate indutível desejado. Este método pode fornecer um controle temporal e especial de mutações de proteínas em camundongos.
Dessa forma, pode-se determinar o efeito de mutações em um tecido específico ou em um estágio específico de desenvolvimento. No momento, estamos usando este sistema para monitorar o estabelecimento dinâmico de outro domínio de cromatina, o complexo repressivo Polycomb 1.
