Мы наметим систему оценки динамического формирования хроматинов. Мы используем эту систему для того чтобы последовать за набором и распространять доменов хроматина PRC2-опосредованного в клетках. Процесс может быть приостановлен в любое время для анализа происходящих событий.
Эта система может быть направлена на мониторинг динамических изменений в любом данном клеточном процессе и, следовательно, не ограничивается отслеживанием формирования хроматина домена. Начните с разработки руководства РНК для удаления exon 10 и 11 эндогенной копии эмбрионального развития эктодерма, или EED, в эмбриональных стволовых клетках мыши с помощью инструмента CRISPR Design Tool. Клонировать руководство РНК в CRISPR/Cas9 плазмид в соответствии с рукописными указаниями.
В формате шести хорошо пластины, transfect 200,000 мыши эмбриональных стволовых клеток, или mESCs, с одним микрограммом каждого руководства РНК с использованием трансфекционных реагентов в соответствии с инструкциями производителя. Изменение мультимедиа через 24 часа после трансфекции. Через два дня после трансфекции изолируйте GFP-положительные ячейки с помощью FACS.
Эффективность трансфекции колеблется от 10 до 30%, поэтому сортируют около 500 000 ячеек, чтобы захватить достаточное количество GFP-положительных ячеек для покрытия. Плита изолированных GFP-положительных клеток в 15-сантиметровые пластины, которые предварительно покрыты 0,1%gelatin для колонии сбора. Выращивать клетки в среде ESC в течение примерно одной недели до тех пор, пока отдельные колонии видны, убедившись, что изменить средства массовой информации каждые два дня.
Выберите минимум 48 колоний с помощью 20-микролитровый пипетка отзыв соскребать над колонией во время аспирации. Не разбивая колонию на одиночные клетки, перенесите ее на аккутазы, содержащие 96-колодец пластины. Инкубировать колонии при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут, чтобы разобщить клетки.
Затем добавьте 200 микролитров СРЕДСТВ ESC к каждой колодец с многоканальной пипеткой. Хорошо перемешать и пластины клеток в две отдельные 96-хорошо пластин. Используйте одну из пластин для генотипирования, и держать другой растет до генотипирования заключен.
Извлекайте ДНК из пластины с помощью коммерческих реагентов и следуя указаниям производителя. Используйте genotyping грунтовки, которые охватывают удаленный сайт для выполнения генотипирования ПЦР с Taq ДНК полимеразы. Наблюдайте продукт дна более низкого молекулярного веса в клетках с homozygous удалением по отношению к одичалым клеткам типа.
Дизайн руководство РНК ввести разрез в интроне после exon 9 EED с помощью инструмента дизайна CRISPR, и клонировать его в CRISPR / Cas9 плазмид в соответствии с рукописными направлениями. Дизайн донорского шаблона ДНК, который включает в себя последовательность EED cDNA после exon 9 и C-терминал Флаг-HA тег вверх по течению от T2A-GFP последовательности, все в обратной ориентации в отношении эндогенной последовательности генов. Фланг кассеты с сращивания-прием и полиаденилирования последовательность вложенных между гетерологических перевернутых локсP сайтов, и включают в себя по крайней мере 500 базовых пар гомологии оружия с каждого конца.
Разделите шаблон донора на два сегмента фрагментов генов gBlocks и соберите их в вектор PCR Blunt с помощью клонирования Gibson в соответствии с инструкциями производителя. В формате шести хорошо пластины, transfect 200,000 mESCs с одним микрограммом направляющий РНК и один микрограмм донорских шаблонов. Затем изолируйте GFP-положительные ячейки с помощью FACS.
Изолировать отдельные колонии для генотипирования в соответствии с рукописными указаниями. Используйте цитометрию потока, чтобы подтвердить, что mESCs не имеют вытекающей экспрессии GFP, и, если они делают, изолировать GFP-отрицательные клетки FACS перед началом эксперимента. Расширьте клетки на пять 15-сантиметровых пластин и индуцируете экспрессию ЭЭВ дикого типа или клетки-мутанта, ввести 5-микромоляный 4-гидрокситамоксифен в течение пяти различных периодов времени от нуля часов до восьми дней.
Изменение средств массовой информации после 12 часов для лечения дольше, чем это. Изолировать успешно рекомбинированную клетку FACS с помощью GFP, и выполнить ChIP-seq для H3K27me2 и H3K27me3, чтобы исследовать их временное осаждение хроматина в ответ на повторное выражение дикого типа или клетки-мутанта EED. Для проверки неопровержимых диких типа спасательных и неопровержимых мутантов спасательных систем, западные пятно было выполнено на целые экстракты после индукции дикого типа или клетки-мутант EED с 4-гидрокситамоксифен лечения.
Анализ цитометрии потока был использован для подтверждения эффективности экспрессии T2A-GFP в клетках i-WT-r до и после лечения 4-гидрокситамоксифеном, что свидетельствует об успешном сальто перевернутой кассеты. ChIP-seq H3K27me3 был выполнен после повторного выражения дикого типа или клетки-мутанта EED. Появление H3K27me3 наблюдается через 12 часов после экспрессии EED дикого типа на дискретных участках нуклеации, а затем в течение 24 часов в регионах, удаленных от исходных мест нуклеации.
ChIP-seq также использовался для отслеживания временного осаждения H3K27me2, которое, как представляется, предшествует осаждению H3K27me3. Очаги H3K27me3 и их рост также визуализированы с помощью микроскопии флуоресценции. После 12 часов выражения EED дикого типа, есть свидетельства образования очагов H3K27me3.
Эти очаги увеличиваются в количестве и размере на 24 часа и в конечном итоге распространяются на большие области ядра на 36 часов. Точная конструкция конструкций ДНК очень важна для создания желаемой индуцируемой спасательной системы. Этот метод может обеспечить временный и особый контроль мутаций белков у мышей.
Таким образом, можно определить влияние мутаций в конкретной ткани или на определенной стадии развития. В настоящее время мы используем эту систему для мониторинга динамического создания другого хроматина домена, Polycomb репрессивный комплекс 1.
