単一細胞微小吸引は、微生物学全般、特にウイルス学の分野で使用される異なる技術を補完する方法である。これは、重要な質問に答え、巨大なウイルスの分離中に遭遇した問題を解決することができ、ターンオーバーウイルス、クランジジンウイルス、およびファウストウイルスである別のものからウジバチウイルスの場合のように、低量のウイルスを提示するウイルス混合物からウイルスを分離し、とにかく高い量に存在する。このアプローチの主な利点は、間接戦略の使用です。
感染した宿主を分離してクローニングしてウイルス分離を得る。そこで、この方法は、細胞の捕獲から放出までの異なるステップを監視し、顕微鏡観察による選別プロセスを確認します。最後に、分子生物学は、分離されたウイルス粒子を観察するために選別および電子顕微鏡を確認するために使用される。
このアプローチは、ウイルス分離の主要な問題を解決します。これは、一般的にアメバのクローニングやクローニングプロティストのための将来です。この技術を初めて使用しようとする人は、圧力を制御する際に厳密かつ正確でなければなりません。
この視覚制御は、1 つのセルのキャプチャとリリースを確認するために不可欠です。セル支持体として、フェルマメーババーミフォルミ、ひずみCDC 19を使用する。75平方センチメートルの細胞培養フラスコに1ミリリットル当たり10倍から6番目の細胞の濃度でPYG培地30ミリリットルとアメーバの3ミリリットルを加える。
インキュベーターで28°Cの文化を維持します。48時間後、アメーバ細胞培養液の10ミリリットルを計数スライドに移し、顕微鏡下に置いてアメーバを定量化する。すすべるために、30ミリリットルの細胞培養物をチューブに収穫し、10分間Gの720倍で遠心分離によりアメーバをペレットにする。
上清を取り除き、適切な量の飢餓培地中のペレットを再懸濁し、1ミリリットル当たり6番目の細胞に10倍の濃度を得る。抗菌剤を添加して細胞サポートを準備する。バイオセーフティキャビネットでは、アメーバ培養の6回目に10倍から6分の1を2ミリリットルの飢餓培地に加えます。
次に、ウイルスの混合物を含むストック溶液を0.01の感染の多重度でアメーバ細胞培養支持体に接種する。感染したアメーバ細胞培養サポートをインキュベートする。10〜14時間、またはアメーバル丸めやリシスなどの細胞パシー効果が誘発されるまで、摂氏30度を加えます。
次に、注射器を使用して培地を収集し、5ミクロンのフィルターを通して濾過して細胞の破片を除去する。異なるウェルで飢餓培地中のウイルスサンプルの穀物希釈を行う。各ペトリ皿に含まれる第6のヴェルマモバ・ヴェルマフォルミスに10倍の2ミリリットルを接種し、100ミリリットルの混合物を接種する。
その後、ペトリ料理を30°Cの密封可能なビニール袋に入れます。感染後6時間で、逆光顕微鏡でペトリ皿を観察し、4〜8時間ごとに細胞形態をチェックする。抗菌処理は細胞のサポートのための。
ペトリ皿の中から、真菌および細菌剤による視覚汚染の存在しないもの、およびウイルスによるアメーバの細胞パシー効果の証拠と、ウイルス粒子の吸引を避けるためにアメーバの前リシスおよび丸め段階を有するものを選択する。マイクロマニピュレータ、手動制御圧力装置、反転顕微鏡、プラグアンドプレイモーターモジュール、カメラ、コンピュータモジュールを備えたワークステーションを設置します。内部位置の維持と細胞の容易な放出を可能にするために20ミクロンの内径のマイクロキャピラリーを選びましょう。
電動モジュールのグリップシステムの動作角度を45度で固定します。最初にグリップシステムで、次にマイクロキャピラリーで、二重インストールを実行します。細胞に焦点を当てます。
細胞をクローン化するには、感染したアメーバの2ミリリットルを含むペトリ皿を顕微鏡の下に置く。まず細胞に焦点を当て、次に培養に浸したマイクロ毛細血管に焦点を当てます。丸みを帯びた単一細胞を選び、マイクロキャピラリーをマイクロマニピュレーターに近づける。
マイクロキャピラリーの内側に取る細胞に手動で圧力制御を加えて柔らかい吸引を行い、最初のサンプルから単一の細胞を取り出し、アメーバの細胞培養サポートで放出します。その後、摂氏30度でインキュベートします。慎重に単一の細胞を熱望し、単一の細胞の放出の観察によってあなたの抱負を制御することができるように圧力を制御する。
反転した光学顕微鏡で毎日観察を行い、細胞の外観を観察し、細胞変性効果の出現を監視します。現在、細胞性効果が観察される陽性培養サンプルの一部からDNAを抽出するために、自動抽出システムを操作します。ファウストウイルスのRBP2、ウスパトウイルスの主要なキャプシドタンパク質、およびクランデスチノウイルスのマイナーキャプシドタンパク質として標識された貧しい遺伝子を増幅するプライマーを設計する。
原稿に従ってサーモサイクラーを使用して標準PCRを行います。各プライマー、1Xマスターミックス、およびリボヌクレアーゼフリー水の50マイクロモルでPCR反応の20マイクロリリライタを実施します。1.5%のアガロースゲルの電圧135ボルトでDNAゲル染色でPCR製品を実行し、UVで可視化します。このプロトコルは単一細胞マイクロ吸引でマイクロマニピュレーションプロセスを最適化する。
この技術は、丸みを帯びて感染したアメーバの捕獲と、感染していないアメーバを含む新規プレートでの放出を可能にする。このアプローチは、Userpatvirus LCD7という新しい低存在量の巨大ウイルスを正常に分離しました。お客様のユーザーパトウイルスは、Userpatvirus LCD7 DNAの存在とファウストウイルスDNAの存在を持つクローン7でのみ観察されました。
電子顕微鏡は、フィブリルのない典型的な異端体形態を有するクランデスチノウイルスST1の出現と、約250ナノメートルの二面体キャプシドを有するウスルパトウイルスLCD7の出現を明らかにした。低細胞測定は、ファウストウイルスとノーボイラスの集団の重複を確認する。マスター化すれば、この手順は簡単に行うことができます。
この手順を試みる際に覚えておくべきことは、作業ステーションの有能な取り扱いと汚染の問題のチェックを持つエンティティのサイズに関する最小限の観察の儀式の必要性です。このアプローチは、細胞形態に基づくソート技法として使用することができる。現在、それは特定のアメーバのクローニングのために私たちの研究室で使用されています.
この手法の重要なポイントの 1 つは、セルの整合性を維持することです。実際、細胞の非観察や放出に問題が生じる可能性があります。これは、主に細胞がマイクロ毛細血管に崩壊するためである。
この方法は、欠陥テレメトリとファクトの並べ替えが利用できない場合や、特定の手法の制限に達した場合に、効率的な代替手段となる可能性があります。場合によっては、細胞がマイクロ毛細血管から放出されないことを忘れないでください。これは、アメーバの特性と、細胞膜から適応し、その後の能力の一部によるものです。
