Single Cell Micro-Aspiration هي طريقة لاستكمال التقنيات المختلفة المستخدمة في مجال علم الأحياء المجهرية بشكل عام وفي علم الفيروسات بشكل خاص. يمكن الإجابة على السؤال الرئيسي وحل المشاكل التي واجهتها خلال عزل الفيروسات العملاقة عن طريق فصل فيروس من خليط الفيروسية التي تقدم وفرة منخفضة الفيروس كما كان الحال بالنسبة للفيروسات دوران, فيروس clandisinal, وفيروس عزباتي من واحد آخر, وهو فاوستوفيروس, موجودة في وفرة عالية على أي حال. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذا النهج في استخدام استراتيجية غير مباشرة.
وهو يتألف من فصل واستنساخ المضيف المصاب للحصول على فصل الفيروسية. لذلك، هذا الأسلوب يراقب الخطوات المختلفة من التقاط إلى الإفراج عن الخلايا وتأكيد عملية الفرز عن طريق المراقبة المجهرية. وأخيراً، يُستخدم علم الأحياء الجزيئي لتأكيد الفرز والمجهر الإلكتروني لمراقبة الجسيمات الفيروسية المنفصلة.
هذا النهج سوف يحل المشكلة الرئيسية لفصل الفيروس. وهو أمر محتمل لاستنساخ أميبا أو استنساخ بروتين بشكل عام. يجب على الشخص الذي يحاول استخدام هذه التقنية للمرة الأولى أن يكون صارما ودقيقا عند السيطرة على الضغط.
عنصر التحكم المرئي ضروري لتأكيد التقاط والإفراج عن خلية واحدة فقط. استخدام فيرماومبا فيرميفورميس، سلالة CDC 19، كدعم الخلية. إضافة 30 ملليلتر من PYG المتوسطة وثلاثة ملليلتر من الأميبا بتركيز واحد من عشرة مرات إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر في قارورة ثقافة خلية 75 سم مربع.
الحفاظ على ثقافة في 28 درجة مئوية في حاضنة. بعد 48 ساعة، نقل 10 ملليلترات من ثقافة خلية الأميبا إلى شريحة العد ووضعها تحت المجهر لتحديد كمية الأميبا. لشطف، حصاد 30 ملليلتر من ثقافة الخلية في أنبوب وبيليه الأميبا عن طريق الطرد المركزي في 720 مرات G لمدة 10 دقائق.
إزالة افرنح و resuspend بيليه في حجم مناسب من التجويع المتوسطة للحصول على تركيز واحد مرات 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر. إعداد الدعم الخلوي مع إضافة عامل مضاد للميكروبات. في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية، إضافة واحدة مرات 10 إلى السادسة من ثقافة الأميبا في مليلتر اثنين من وسط المجاعة.
ثم تلقيح 100 ملليلتر من محلول الأسهم التي تحتوي على خليط من الفيروسات في الخلية الأميبا دعم ثقافة في تعدد العدوى من 0.01. احتضان الخلية الأميبا المصابة دعم الثقافة. إضافة 30 درجة مئوية لمدة 10 إلى 14 ساعة أو حتى يتم حث الآثار السيتوباثية مثل التقريب أميبال أو تحلل.
بعد ذلك ، استخدم حقنة لجمع الوسائط ولتر من خلال مرشح خمسة ميكرون لإزالة الحطام الخلوي. تنفيذ تخفيف الحبوب من العينة الفيروسية في وسط المجاعة في آبار مختلفة. تلقيح مليلترين من مرة واحدة 10 إلى Vermamoba Vermaformis السادس الواردة في كل طبق بيتري مع 100 ملليلتر من الخليط inoculum.
ثم، ضع أطباق بيتري في كيس بلاستيكي قابل للغلق عند 30 درجة مئوية. في ست ساعات بعد العدوى، ومراقبة أطباق بيتري مع المجهر البصري المقلوب وفحص مورفولوجيا الخلية كل أربع إلى ثماني ساعات. العلاج المضاد للميكروبات هو للدعم الخلوي.
حدد من بين أطباق بيتري تلك التي تغيب عن أي تلوث بصري من قبل العوامل الفطرية والبكتيرية ومع أدلة على تأثير cytopathic من الأميبا بسبب الفيروسات ومع مرحلة ما قبل الانحلال وتدوير الأميبا لتجنب طموح الجسيمات الفيروسية. قم بإعداد محطة عمل مع جهاز التحكم اليدوي، وجهاز ضغط التحكم اليدوي، والمجهر المقلوب، ووحدات توصيل وتشغيل المحركات، والكاميرا، ووحدة الكمبيوتر. اختيار شعري صغير من 20 ميكرون القطر الداخلي للسماح لصيانة موقف داخلي والإفراج عن السهل من الخلية.
إصلاح زاوية التشغيل لنظام تجتاح على وحدة بمحرك في 45 درجة. إجراء تثبيت مزدوج، أولا على نظام تجتاح ثم على شعري صغير. ركز على الخلايا
لاستنساخ الخلايا، ضع طبق بيتري الذي يحتوي على مليلترين من الأميبا المصابة تحت المجهر. التركيز أولا على الخلايا ثم على الشعرية الصغيرة مغمورة في الثقافة. قطف خلية واحدة مدورة و جلب الشعيرات الدموية الصغيرة أقرب إلى micromanipulator.
بذل طموح لينة مع التحكم في الضغط اليدوي على الخلية الاستيلاء عليها داخل الشعرية الصغيرة إزالة الخلية واحدة من العينة الأولى والإفراج عنها في دعم ثقافة الخلية الأميبا. ثم احتضانه في 30 درجة مئوية. السيطرة بعناية على الضغط لتكون قادرة على التطلع خلية واحدة والسيطرة على طموحك من خلال مراقبة الإفراج عن خلية واحدة.
إجراء ملاحظات يومية مع المجهر البصري المقلوب لمراقبة ظهور الخلايا ورصد ظهور تأثير cytopathic. الآن تشغيل نظام استخراج الآلي لاستخراج الحمض النووي من جزء من عينات الثقافة الإيجابية حيث لوحظ تأثير cytopathic. تصميم التمهيدي لتضخيم الجينات الفقيرة مشروحة كما RBP2 لفيروس فاوستو، البروتين الكبسي الرئيسي لفيروس الغاصب، والبروتين capsid طفيفة لفيروس Clandestino.
تنفيذ PCR القياسية باستخدام ثيرموسيفير وفقا للمخطوطة. تنفيذ 20 ميكروليلترات من تفاعلات PCR مع 50 ميكرومولار من كل التمهيدي، 1X ماجستير ميكس، وrريبونوكليس المياه الحرة. تشغيل المنتجات PCR مع وصمة عار هلام الحمض النووي على هلام agarose 1.5٪ في الجهد من 135 فولت وتصور مع الأشعة فوق البنفسجية. هذا البروتوكول يحسن عملية micromanipulation مع طموح صغير خلية واحدة.
هذه التقنية تمكن من التقاط الأميبا مدورة والمصابة وإطلاقها في لوحة رواية تحتوي على الأميبا غير المصابة. هذا النهج عزل بنجاح جديدة منخفضة الوفرة العملاقة فيروس اسمه Userpatvirus LCD7. وقد لوحظ فقط فيروس المستخدم الخاص بك في استنساخ سبعة مع وجود الحمض النووي المستخدم فيروس LCD7 وغياب الحمض النووي فيروس فاوستو.
كشف المجهر الإلكتروني ظهور Clandestinovirus ST1، الذي يحتوي على مورفولوجيا نموذجية icosahedral دون fibrils وكذلك Usurpatvirus LCD7 مع capsid icosahedral من حوالي 250 نانومتر. انخفاض قياس استئصال الدم يؤكد تداخل مجموعات فيروس فاوستو ونوفوروس. مرة واحدة يتقن، يمكن أن يتم هذا الإجراء بسهولة.
أهم شيء يجب تذكره عند محاولة هذا الإجراء هو ضرورة وجود حد أدنى من الملاحظات الطقسية فيما يتعلق بحجم الكيانات مع حسن التعامل مع المختصين في محطة العمل والتحقق من أي مشكلة تلوث. ويمكن استخدام هذا النهج كتقنية فرز على أساس مورفولوجيا الخلية. حاليا يتم استخدامه في مختبرنا لاستنساخ الأميبا محددة.
نقطة واحدة حرجة من هذه التقنية هو الحفاظ على سلامة الخلية. في الواقع، يمكن أن يكون لدينا بعض المشاكل مع عدم مراقبة الخلية أو الإفراج. ويرجع ذلك في الغالب إلى تفكك الخلية في الشعيرات الدموية الدقيقة.
ويمكن أن تكون هذه الطريقة بديلا فعالا عندما لا يكون القياس عن بعد أو الفرز عن بعد غير متوفرين وعندما يتم التوصل إلى قيود تقنية محددة. لا ننسى أنه في بعض الحالات لا يتم تحرير الخلية من الشعرية الصغيرة. ويرجع ذلك جزئيا إلى خصائص الأميبا وقدرتها على التكيف ومن ثم من غشاء الخلية.
