단세포 마이크로 포부는 미생물학 분야에서 일반적으로 그리고 특히 바이러스학에서 사용되는 상이한 기술을 보완하는 방법입니다. 그것은 주요 질문에 대답 하 고 바이러스 를 제시 하는 바이러스 혼합물에서 바이러스를 분리 하 여 발생 하는 문제를 해결할 수 있습니다 낮은 풍부한 바이러스를 제시 하는 바이러스 바이러스, 은밀한 바이러스, 그리고 다른 하나에서 uzibati 바이러스, 파우스토 바이러스는 어쨌든 높은 풍부에 존재. 이 방법의 주요 장점은 간접 전략의 사용입니다.
감염된 숙스를 분리하고 복제하여 바이러스 분리를 얻는 것으로 구성됩니다. 따라서 이 방법은 포획에서 세포 방출까지의 다양한 단계를 모니터링하고 현미경 관찰에 의한 선별 과정을 확인합니다. 마지막으로, 분자 생물학은 분리된 바이러스 입자를 관찰하기 위해 선별 및 전자 현미경 검사를 확인하는 데 사용된다.
이 방법은 바이러스 분리의 주요 문제를 해결할 것입니다. 그것은 일반적으로 아메바를 복제하거나 프로테스트를 복제하기위한 예비입니다. 처음으로이 기술을 사용 하려고하는 사람은 압력을 제어 할 때 엄격하고 정확해야합니다.
시각적 제어는 하나의 셀의 캡처 및 방출을 확인하는 데 필수적입니다. 베르마모에바 베르미포르미스, 변형 CDC 19를 세포 지지체로 사용하십시오. 75 평방 센티미터 세포 배양 플라스크에서 밀리리터 당 여섯 번째 세포에 10 배의 농도에 PYG 배지의 30 밀리리터와 아메바의 3 밀리리터를 추가합니다.
인큐베이터에서 섭씨 28도에서 문화를 유지하십시오. 48시간 후, 아메바 세포 배양10밀리리터를 카운팅 슬라이드로 옮기고 현미경으로 배치하여 아메배를 정량화한다. 헹구려면, 튜브에서 세포 배양의 30 밀리리터를 수확하고 10분 동안 720회 G에서 원심분리로 아메배를 펠릿한다.
상체를 제거하고 밀리리터당 1회 10분의 1의 농도를 얻기 위해 기아 배지의 적절한 부피에서 펠릿을 재연한다. 항균제의 첨가로 세포 지원을 준비한다. 생물 안전 캐비닛에서 아메바 문화의 여섯 번째에 10번을 기아 배지 2밀리리터에 넣습니다.
이어서 0.01의 다형성에서 아메배 세포 배양 지원에 바이러스의 혼합물을 함유한 스톡 용액100밀리리터를 접종한다. 감염된 아메배 세포 배양 지원을 배양한다. 10~14시간 동안 섭씨 30도를 추가하거나 아메발 반올림 또는 용해와 같은 세포병증 효과가 유발될 때까지 추가하십시오.
다음으로 주사기를 사용하여 미디어를 수집하고 5미크론 필터를 통해 여과하여 셀룰러 이물질을 제거합니다. 다른 우물에서 기아 배지에서 바이러스 성 샘플의 시리얼 희석을 수행합니다. 혼합물 접종의 100 밀리리터와 각 페트리 접시에 포함 된 여섯 번째 베르마모바 베르마 포르미에 1 회 10 의 2 밀리리터를 접종.
그런 다음 페트리 요리를 밀봉 가능한 비닐 봉지에 섭씨 30도에 넣습니다. 감염 후 6시간 에서, 반전된 광학 현미경으로 페트리 접시를 관찰하고 4~8시간마다 세포 형태를 확인하십시오. 항균 치료는 세포 지원을 위한 것입니다.
페트리 접시 중에서 곰팡이와 세균성 제제에 의한 시각적 오염이 없는 것과 바이러스로 인한 아모에배의 세포병증 효과의 증거와 바이러스 입자의 포부를 피하기 위해 아메배의 사전 용해 및 반올림 단계의 증거를 선택하십시오. 마이크로 조작기, 수동 제어 압력 장치, 반전 된 현미경, 플러그 앤 플레이 모터 모듈, 카메라 및 컴퓨터 모듈로 워크 스테이션을 설정합니다. 내부 위치의 유지 및 세포의 쉬운 방출을 허용하기 위해 20 미크로인 내부 직경의 마이크로 모세관을 선택합니다.
전동 모듈의 그립 시스템의 작동 각도를 45도로 수정합니다. 먼저 그립 시스템에 두 번 설치한 다음 마이크로 모세관에 설치합니다. 셀에 집중합니다.
세포를 복제하려면 감염된 아메배 2밀리리터를 함유한 페트리 접시를 현미경 으로 놓습니다. 먼저 세포에 초점을 맞춘 다음 배양에 침지된 마이크로 모세관에 집중하십시오. 둥근 단세포를 따기와 마이크로 조작기에 가까운 마이크로 모세관을 가져옵니다.
마이크로 모세관 내부를 복용하는 세포에 수동 압력 조절을 사용하여 부드러운 포부를 발휘하여 첫 번째 샘플에서 단일 세포를 제거하고 아메배의 세포 배양 지원에 방출한다. 그런 다음 섭씨 30도에서 배양하십시오. 단일 셀을 갈망하고 단일 셀의 방출을 관찰하여 포부를 제어 할 수있는 압력을 신중하게 제어할 수 있습니다.
세포의 출현을 관찰하고 세포 병증 효과의 출현을 모니터링하기 위해 반전 된 광학 현미경으로 매일 관찰을 수행합니다. 이제 세포병증 효과가 관찰되는 양성 배양 샘플의 일부에서 DNA를 추출하기 위해 자동화된 추출 시스템을 운영하고 있습니다. 파우스토바이러스의 RBP2로 부음된 가난한 유전자, 우수르트바이러스의 주요 캡시드 단백질, 클랜데스티노바이러스의 경미한 캡시드 단백질을 증폭시키는 프라이머를 설계한다.
원고에 따라 써모사이클러를 사용하여 표준 PCR을 수행합니다. 각 프라이머의 50 마이크로몰라, 1X 마스터 믹스 및 리보누프리 워터의 50 마이크로릴리터20마이크로릴리터를 수행합니다. 135볼트의 전압에서 DNA 젤 얼룩으로 PCR 제품을 1.5% 아가로즈 젤에 바르고 UV로 시각화합니다. 이 프로토콜은 단일 셀 마이크로 포부로 미세 조작 프로세스를 최적화합니다.
이 기술은 둥글고 감염된 아메바와 감염되지 않은 아메배를 포함하는 새로운 판에서 방출을 포착할 수 있게 한다. 이 방법은 Userpatvirus LCD7이라는 이름의 새로운 저풍 거대 바이러스를 성공적으로 격리했습니다. Userpatvirus는 Userpatvirus LCD7 DNA의 존재와 파우스토 바이러스 DNA의 부재와 클론 7에서만 관찰되었다.
전자 현미경 검사법은 약 250 나노미터의 icosahedral 캡시드와 유혈구없이 전형적인 icosahedral 형태뿐만 아니라 Usurpatvirus LCD7을 가지고 Clandestinovirus ST1의 모양을 밝혔다. 낮은 세포질은 파우스토바이러스와 나부리우스의 인구가 겹치는 것을 확인합니다. 일단 마스터되면이 절차를 쉽게 수행 할 수 있습니다.
이 절차를 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 워크 스테이션의 유능한 처리와 오염 문제의 확인을 가진 개체의 크기에 관한 최소한의 관찰 의식의 필요성입니다. 이 방법은 세포 형태에 기초하여 선별 기술로 사용될 수 있습니다. 현재 그것은 특정 아메바의 복제에 대 한 우리의 실험실에서 사용 됩니다.
이 기술의 한 가지 중요한 점은 세포 무결성을 유지하는 것입니다. 실제로, 우리는 세포 또는 방출의 비 관찰에 몇 가지 문제가있을 수 있습니다. 이것은 주로 마이크로 모세관으로 세포의 붕괴 때문입니다.
이 방법은 결함 원격 분석 및 팩트 정렬을 사용할 수 없는 경우와 특정 기술 제한에 도달할 때 효율적인 대안이 될 수 있습니다. 어떤 경우에는 세포가 마이크로 모세관에서 방출되지 않는다는 것을 잊지 마십시오. 이것은 아메배 특성과 세포막에서 적응하는 그들의 능력에 부분적으로 기인합니다.
