La micro-aspirazione a cella singola è un metodo per integrare le diverse tecniche utilizzate nel campo della microbiologia in generale e in virologia in particolare. Potrebbe rispondere alla domanda chiave e risolvere i problemi incontrati durante l'isolamento dei virus giganti separando un virus da una miscela virale che presenta un virus a bassa abbondanza come nel caso di virus turnover, virus clandisinale e virus uzibati da un altro, che è Faustovirus, presente comunque in alta abbondanza. Il principale vantaggio di questo approccio è l'uso di una strategia indiretta.
Consiste nel separare e clonare l'ospite infetto per ottenere una separazione virale. Quindi, questo metodo monitora i diversi passaggi dall'acquisizione al rilascio delle cellule e conferma il processo di ordinamento mediante osservazione microscopica. Infine, la biologia molecolare viene utilizzata per confermare lo smistamento e la microscopia elettronica per osservare le particelle virali separate.
Questo approccio risolverà il principale problema della separazione dei virus. Si tratta di una prospettiva di clonazione ameba o di clonazione di protisti in generale. La persona che sta cercando di utilizzare questa tecnica per la prima volta deve essere rigorosa e precisa quando controlla la pressione.
Il controllo visivo è essenziale per confermare l'acquisizione e il rilascio di una sola cella. Utilizzare Vermamoeba Vermiformis, ceppo CDC 19, come supporto cellulare. Aggiungere 30 millilitri di mezzo PYG e tre millilitri dell'ameba a una concentrazione di una per dieci alla sesta cella per millilitro in un pallone da coltura cellulare di 75 centimetri quadrati.
Mantenere la coltura a 28 gradi Celsius in un incubatore. Dopo 48 ore, trasferire 10 millilitri della coltura cellulare dell'ameba su uno scivolo di conteggio e posizionarlo al microscopio per quantificare le amebe. Per risciacquare, raccogliere 30 millilitri della coltura cellulare in un tubo e pelletare l'amebae per centrifugazione a 720 volte G per 10 minuti.
Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet nel volume appropriato del mezzo di fame per ottenere la concentrazione di una volta 10 alla sesta cellule per millilitro. Preparare il supporto cellulare con l'aggiunta di agente antimicrobico. In un armadio di biosicurezza, aggiungere uno per 10 al sesto della coltura di ameba in due millilitri di mezzo di fame.
Quindi inoculare 100 millilitri della soluzione stock contenente la miscela di virus nel supporto di coltura cellulare delle amebe a una molteplicità di infezione di 0,01. Incubare il supporto per la coltura delle cellule amebe infette. Aggiungere 30 gradi Celsius per 10-14 ore o fino a quando non vengono indotti effetti citopatici come arrotondamento amebale olisi.
Quindi, utilizzare una siringa per raccogliere il supporto e filtrare attraverso un filtro da cinque micron per rimuovere i detriti cellulari. Eseguire una diluizione dei cereali del campione virale nel mezzo di fame in diversi pozzi. Inoculare due millilitri da uno per 10 al sesto Vermamoba Vermaformis contenuto in ogni piastra di Petri con 100 millilitri della miscela inoculo.
Quindi, posizionare le piastre di Petri in un sacchetto di plastica sigillabile a 30 gradi Celsius. A sei ore dall'infezione, osservare le piastre di Petri con microscopia ottica invertita e controllare la morfologia cellulare ogni quattro o otto ore. Il trattamento antimicrobico è per il supporto cellulare.
Selezionare tra le piastre di Petri quelle assenti da qualsiasi contaminazione visiva da agenti fungini e batterici e con evidenza di effetto citopatico delle amebe dovute ai virus e con prelisi e fase di arrotondamento delle amebe per evitare l'aspirazione di particelle virali. Impostare una stazione di lavoro con micro manipolatore, dispositivo di pressione di controllo manuale, microscopio invertito, moduli Plug and Play Motor, fotocamera e modulo computer. Scegli un micro capillare di 20 micron di diametro interno per consentire la manutenzione di una posizione interna e un facile rilascio della cella.
Fissare l'angolo di funzionamento del sistema di presa sul modulo motorizzato a 45 gradi. Eseguire una doppia installazione, prima sul sistema di presa e poi sul micro capillare. Concentrati sulle celle.
Per clonare le cellule, posizionare la piastra di Petri contenente due millilitri di amebe infette al microscopio. Concentrati prima sulle cellule e poi sul micro capillare immerso nella coltura. Raccogliere una singola cella arrotondata e avvicinare il micro capillare al micromanipolatore.
Esercitare un'aspirazione morbida con controllo manuale della pressione sulla cella prendendola all'interno del micro capillare Rimuovere la singola cella dal primo campione e rilasciarla nel supporto di coltura cellulare dell'amebae. Quindi incubarlo a 30 gradi Celsius. Controlla attentamente la pressione per poter aspirare una singola cellula e controllare la tua aspirazione mediante l'osservazione del rilascio di una singola cellula.
Condurre osservazioni giornaliere con un microscopio ottico invertito per osservare l'aspetto delle cellule e monitorare l'emergere dell'effetto citopatico. Ora aziona un sistema di estrazione automatizzato per estrarre il DNA da parte dei campioni di coltura positiva in cui si osserva un effetto citopatico. Primer di progettazione per amplificare i geni poveri annotati come RBP2 per Faustovirus, proteina capsid principale per usurpatvirus e proteina capsid minore per il Clandestinovirus.
Eseguire pcr standard utilizzando un termociclometro secondo il manoscritto. Effettuare 20 microlitri di reazioni PCR con 50 micromolari di ogni primer, 1X Master Mix e acqua priva di ribonucleasi. Eseguire i prodotti PCR con macchia di gel DNA su un gel di agarosio all'1,5% alla tensione di 135 volt e visualizzare con UV. Questo protocollo ottimizza un processo di micromanipolazione con micro aspirazione a cella singola.
Questa tecnica consente la cattura di un'ameba arrotondata e infetta e il suo rilascio in una nuova lastra contenente amebe non infette. Questo approccio ha isolato con successo un nuovo virus gigante a bassa abbondanza chiamato Userpatvirus LCD7. Il tuo Userpatvirus è stato osservato solo nel clone sette con presenza di DNA LCD7 userpatvirus e assenza di DNA Faustovirus.
La microscopia elettronica ha rivelato l'aspetto del Clandestinovirus ST1, che ha una tipica morfologia icosaedrale senza fibrille così come l'Usurpatvirus LCD7 con un capsid icosaedro di circa 250 nanometri. La bassa citometria conferma la sovrapposizione delle popolazioni di Faustovirus e Nauvoirus. Una volta padroneggiata, questa procedura può essere eseguita facilmente.
La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è la necessità di un rituale minimo di osservazioni riguardanti le dimensioni degli enti con la buona gestione della competente del posto di lavoro e il controllo di eventuali problemi di contaminazione. Questo approccio può essere utilizzato come tecnica di smistamento sulla base della morfologia cellulare. Attualmente viene utilizzato nel nostro laboratorio per la clonazione di ameba specifica.
Un punto critico di questa tecnica è mantenere l'integrità della cella. In effetti, possiamo avere alcuni problemi con la mancata osservazione della cellula o il rilascio. Ciò è dovuto principalmente alla disintegrazione della cellula nel micro capillare.
Questo metodo potrebbe essere un'alternativa efficiente quando la telemetria dei difetti e l'ordinamento dei fatti non sono disponibili e quando vengono raggiunte specifiche limitazioni tecniche. Non dimenticare che in alcuni casi la cellula non viene rilasciata dal micro capillare. Ciò è dovuto in parte alle caratteristiche delle amebe e alla loro capacità di adattamento e quindi dalla membrana cellulare.
