Tek Hücreli Mikro-Aspirasyon, genel olarak mikrobiyoloji alanında ve özellikle virolojide kullanılan farklı teknikleri tamamlayan bir yöntemdir. Bu ciro virüsler, klozzial virüs ve uzibati virüsü başka bir, faustovirus, zaten yüksek bolluk mevcut olduğu gibi düşük bolluk Virüs sunan bir viral karışımdan bir virüs ayırarak anahtar soru cevap ve sorunları çözmek olabilir. Bu yaklaşımın en büyük avantajı dolaylı bir stratejinin kullanılmasıdır.
Bu ayıran ve viral bir ayrım elde etmek için enfekte konak klonlama oluşur. Yani, bu yöntem hücrelerin salınımına yakalamadan farklı adımları izler ve mikroskobik gözlem ile sıralama işlemini onaylar. Son olarak, moleküler biyoloji ayrılmış viral parçacıkları gözlemlemek için sıralama ve elektronik mikroskopi onaylamak için kullanılır.
Bu yaklaşım virüs ayırma büyük sorunu çözecektir. Bu genel olarak ameba klonlama veya protistler klonlama için bir prospektif. Bu tekniği ilk kez kullanmaya çalışan kişi basıncı kontrol ederken titiz ve hassas olmalıdır.
Yalnızca bir hücrenin yakalanmasını ve serbest bırakılmasını onaylamak için görsel kontrol gereklidir. Vermamoeba Vermiformis kullanın, suş CDC 19, bir hücre desteği olarak. 75 santimetre karelik hücre kültürü şişesinde mililitre başına altıncı hücrelere bir kere on konsantrasyonla 30 mililitre PYG orta ve üç mililitre amip ekleyin.
Bir kuvözde 28 santigrat derecede kültürü koruyun. 48 saat sonra, bir sayma slayt üzerine amip hücre kültürünün 10 mililitre aktarın ve amip ölçmek için bir mikroskop altında yerleştirin. Durulama için, bir tüp içinde hücre kültürünün 30 mililitre hasat ve 10 dakika için 720 kez G santrifüj ile amip pelet.
Supernatant çıkarın ve mililitre başına altıncı hücrelere bir kez 10 konsantrasyonelde etmek için açlık orta uygun hacimde pelet resuspend. Antimikrobiyal ajan ilavesi ile hücresel destek hazırlayın. Bir biyogüvenlik kabinesinde, iki mililitre açlık ortamına amip kültürünün altıncısına 10 kez ekleyin.
Daha sonra 0.01 enfeksiyon çokluğu amip hücre kültürü destek içine virüs karışımı içeren stok çözeltisi 100 mililitre aşılayın. Enfekte amip hücre kültürü desteği kuluçka. 10 ila 14 saat veya sitopatik etkileri amip yuvarlama veya lysis gibi indüklenene kadar 30 derece santigrat ekleyin.
Daha sonra, medya toplamak ve hücresel enkaz kaldırmak için beş mikron filtre ile filtrrate toplamak için bir şırınga kullanın. Farklı kuyularda açlık orta viral örnek bir tahıl seyreltme gerçekleştirin. Bir kez iki mililitre aşılamak 10 altıncı Vermamoba Vermaformis karışımı inoculum 100 mililitre ile her Petri kabında bulunan.
Sonra, Petri kaplarını 30 santigrat derecede mühürlenebilir bir plastik torbaya yerleştirin. Enfeksiyon sonrası altı saat, ters optik mikroskopi ile Petri kapları gözlemlemek ve hücre morfolojisi her dört ila sekiz saatte bir kontrol edin. Anti-mikrobiyal tedavi hücresel destek içindir.
Petri yemekleri arasında mantar ve bakteriyel ajanlar tarafından herhangi bir görsel kontaminasyon olmayan ve virüsler nedeniyle amip sitopatik etkisi kanıt ve viral parçacıkların aspirasyon önlemek için amip öncesi lizis ve yuvarlama fazı ile seçin. Mikro manipülatör, manuel kontrol basınç cihazı, ters mikroskop, Tak ve Çalıştır Motor modülleri, kamera ve bilgisayar modülü ile bir iş istasyonu ayarlayın. Bir iç pozisyon ve hücrenin kolay bir serbest bakımı sağlamak için 20 mikron iç çapı bir mikro kılcal seçin.
Motorlu modüldeki kavrama sisteminin çalışma açısını 45 derecede düzeltin. Bir çift kurulum gerçekleştirin, ilk kavrama sistemi ve daha sonra mikro kılcal. Hücrelere odaklan.
Hücreleri klonlamak için, mikroskop altında enfekte amip iki mililitre içeren Petri çanak yerleştirin. Önce hücrelere, sonra da kültüre dalmış mikro kılcal damarlara odaklanın. Yuvarlak tek hücreyi seçmek ve mikro kılcal damarı mikromanipülatöre yaklaştırmak.
Mikro kılcal damarın içine alarak hücre üzerinde manuel basınç kontrolü ile yumuşak aspirasyon uygulayın İlk örnekten tek hücreyi çıkarın ve amip hücre kültürü desteği bırakın. Sonra 30 derecede kuluçkaya yat. Tek bir hücreyi arzulayabilmek için basıncı dikkatlice kontrol edin ve tek bir hücrenin salınımını gözlemleyerek aspirasyonunuzu kontrol edin.
Hücrelerin görünümünü gözlemlemek ve sitopatik etkinin ortaya çıkışını izlemek için ters optik mikroskopla günlük gözlemler gerçekleştirin. Şimdi sitopatik etki gözlenen pozitif kültür örneklerinin bir kısmından DNA çıkarmak için otomatik bir ekstraksiyon sistemi çalıştırın. Faustovirus için RBP2, Usurpatvirus için majör kapsid proteini ve Clandestinovirus için minör kapsid proteini olarak eklenmiş kötü genleri güçlendirmek için tasarım astarları.
El yazmasına göre bir termocycler kullanarak standart PCR gerçekleştirin. Her astar, 1X Master Mix ve ribonükleaz içermeyen su 50 mikromolar ile PCR reaksiyonları 20 mikroliliters yürütmek. PCR ürünlerini 135 volt voltajda %1,5 agarose jel üzerinde DNA jeli lekesi ile çalıştırın ve UV ile görselleştirin. Bu protokol tek hücreli mikro aspirasyon ile bir mikromanipülasyon süreci optimize eder.
Bu teknik, yuvarlak ve enfekte amip lerin yakalanmasını ve enfekte olmamış amipiçeren yeni bir plaka içinde piyasaya sürülmesini sağlar. Bu yaklaşım başarıyla Userpatvirus LCD7 adlı yeni bir düşük bolluk dev virüs izole. Userpatvirus'unuzun sadece 7.
Elektron mikroskopisi, fibriller olmadan tipik bir ikosahedral morfolojisi olan Clandestinovirus ST1'in yanı sıra yaklaşık 250 nanometre lik bir ikosahedral kapsidile Usurpatvirus LCD7 görünümünü ortaya çıkardı. Düşük sitometri Faustovirus ve Nauvoirus popülasyonlarının örtüştünşunu doğrular. Bir kez hakim, bu yordamı kolayca yapılabilir.
Bu prosedürü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, iş istasyonunun yetkin lerinin iyi idaresi ve herhangi bir kontaminasyon sorununun kontrolü ile varlıkların büyüklüğü ile ilgili minimum gözlem ritüelinin gerekliliğidir. Bu yaklaşım hücre morfolojisi temelinde bir sıralama tekniği olarak kullanılabilir. Şu anda laboratuarımızda belirli amiplerin klonlanmasında kullanılmaktadır.
Bu tekniğin kritik noktalarından biri hücre bütünlüğünü korumaktır. Gerçekten de, biz hücre veya serbest olmayan gözlem ile bazı sorunlar olabilir. Bu çoğunlukla mikro kılcal içine hücrenin parçalanması kaynaklanmaktadır.
Bu yöntem, kusur telemetrisi ve olgu sıralama sıyrık kullanılamadığında ve belirli teknik sınırlamaları elde edildiğinde etkili bir alternatif olabilir. Bazı durumlarda hücre mikro kılcal serbest olmadığını unutmayın. Bu kısmen amip özellikleri ve uyum ve daha sonra hücre zarından kapasite kaynaklanmaktadır.
