分化されたSBNET細胞は成長が遅く、伝播しにくい。いくつかの確立された細胞株は、研究者に容易に利用できません。これらの制限を克服するために、我々はこの3D培養プロトコルを開発しました。
SBNET細胞株を確立する従来の方法よりもこの技術の利点は、3D培養を取得することができ、薬物検査は3週間以内に行うことができるということです。この方法は、膵臓由来の神経内分泌腫瘍などの他の神経内分泌腫瘍に適用することができる。切除された患者SBNETサンプルを得た後、それを5ミリメートルキューブに切り、輸送用の円錐管内のDMEM F12培地の25ミリリットルに保管します。
原稿の指示に従って調製した洗浄媒体中の腫瘍を15分間インキュベートする。その後、新しい皿にそれらを転送し、滅菌湾曲したはさみを使用して1ミリメートル未満にそれらをミンチ。25ミリリットルの洗浄媒体を含む新しい50ミリリットルチューブにひき肉組織を移し、500倍gでサンプルを摂氏4度で15分間遠心分離します。
上清を捨て、コラゲナーゼとDNaseで10ミリリットルの洗浄媒体でペレットを再懸濁します。ひき肉の腫瘍を摂氏37度で消化し、90分間ゆっくりと揺れる。腫瘍サンプルを過剰に消化しないことが重要です。
酵素が多すぎたり、インキュベーション時間が長すぎると、SBNET細胞が死滅します。消化が完了した後、500回グラムでチューブを摂氏4度で15分間遠心分離する。上清を捨て、15ミリリットルの洗浄媒体でペレットを再懸濁します。
新しい50ミリリットルチューブの上に70マイクロメートルの細胞ストレーナーを置き、ストレーナーを通して洗浄バッファーの10ミリリットルを移動します。細胞が側面に付着するのを防ぐために、チューブ内の洗浄バッファーを旋回します。次に、ストレーナーを通して細胞懸濁液を濾過する。
500倍gで細胞を摂氏4度で15分間遠心分離する。上清を捨て、200マイクロリットルの洗浄媒体でペレットを再懸濁します。チューブを氷の上に置き、ヘモサイトメーターで細胞を数えるために5マイクロリットルの細胞を使用します。
細胞数を計算し、遠心分離を繰り返して上清を除去し、液体ECM中の細胞を1ミリリットル当たり100万個の細胞の濃度で再懸濁します。次に、ECMのSBNETスフェロイドを5~20マイクロリットルの96ウェルプレートに移し、37°Cのインキュベーターにプレートを入れて液体ECMを固めます。SBNET培地を200マイクロリットルのSBNET培養培地を、前述のように幹細胞培地中のスフェロイドまたは培養を含む各ウェルに添加する。
P1000ピペットを使用してオルガノイドを1.5ミリリットルチューブに移し、チューブを1、500倍gで遠心して上清を取り除きます。PBSと遠心分離機の1ミリリットルで培養液を洗浄し、上清を除去します。その後、500マイクロリットルのパラホルムアルデヒドを加え、15分間インキュベートしてオルガノイドを固定します。
インキュベーション後、培養液を1ミリリットルのPBSで2回洗浄する。3%BSAと0.1%トリトンX-100でPBSの500マイクロリットルを加え、培養液を透過させます。チューブを5分間インキュベートし、オルガノイドをPBS1ミリリットルと3%BSAで3回洗浄します。
次に、一次抗体で培養を1時間培養し、PBSおよびBSAでの使用を繰り返します。二次抗体でインキュベートし、吸引し、すべての上清を捨てるように、このすすを繰り返します。スフェロイドを画像化するには、DAPIを含む取り付け媒体を5マイクロリットル加え、P20ピペットを使用して5マイクロリットルのスフェロイドをガラススライドに移します。
10、20、および 40X の目標を使用して、蛍光顕微鏡でカバースリップと画像でスライドをシールします。P1000ピペットでECMを機械的に破壊し、滅菌1.5ミリリットルチューブに移します。チューブを摂氏4度で1,000倍gで遠心分離する。
その後、すべての上清を除去し、氷の上にチューブを置きます。ペレットに新しいECMの2〜4倍の体積を加え、気泡の導入を避けるために上下にピペットを10回ずつ入れてチューブの内容物を混ぜます。ECMとSBNET混合物の5〜20マイクロリットルを新しい96ウェルプレートに移し、ECMを固化させます。
次に、固化したECMを新しいSBNET培地で覆い、プレートをインキュベーターに入れます。SBNET スフェロイドを別のラボに出荷する場合は、新しい ECM を含むスフェロイドを T25 フラスコに転送し、ECM を固めます。フラスコにSBNETスフェロイド培地を充填し、キャップをしっかりとねじ込み、配送パッケージを準備します。
スフェロイド培養液を受け取った後、培養液を除去し、前工程を繰り返して、スフェロイドを培地に戻す。SBNETスフェロイド増殖速度を顕微鏡イメージングでモニタリングした。SBNETスフェロイドのサイズが週に1回変更されると、約14日かかります。
培養で14日後、SBNETスフェロイドはサイズが大きくならない。スフェロイドをシナプトフィシン、クロモグラニンA、およびSSTR2に特異的な抗体で染色し、免疫蛍光顕微鏡を用いて画像化した。データは、これらのマーカーが細胞質およびSBNET細胞の膜に局在していることを示した。
抗体の特異性を確保するために、シナプトフィシン、クロモグラニンAおよびSSTR2を発現しない膵臓腫瘍からのオルガノイドラインに対して同じ染色手順を行い、緑色のシグナルは検出されなかった。免疫蛍光イメージングの主な利点は、4時間以内に行い、免疫検査と同様の染色情報を与えることができるということです。SBNETをスフェロイドとして培養することは、SBNET増殖を阻害する薬剤を同定するための貴重な技術である。
スフェロイドをラパマイシンおよびmTOR阻害剤で処理した。5日後、ラパマイシン処理されたスフェロイドはブドウのような構造を形成し、アポトーシスまたは壊死性となった。この手順を試みる場合、細胞ストレーナーおよびコレクションチューブを洗浄媒体で予め濡らすることが重要である。
これにより、SBNET細胞が細胞ストレーナーやプラスチックチューブに付着するのを防ぎます。このプロトコルを使用すると、科学者や臨床医は、切除された腫瘍からSBNETスフェロイド培養を確立し、他の研究所と共有し、FDA承認薬の検査に使用することができます。
