このプロトコルは、現在これらのプラークを標識するためのゴールドスタンダードであるアミロイド特異的抗体と比較して、β-アミロイドプラークを正確に標識するための最も効率的かつ費用対効果の高い方法です。この手法は、一般的に使用されるアミロイドラベリング方法と同様に、より少ない時間を要し、同様に効果的です。クルクミンはアミロイドプラークに強く結合し、脳のPETスキャン中および肛門走査を用いた比較的非侵襲的スクリーニングのためにイメージングプローブとして使用することができる。
クルクミンはまた、アルツハイマー病の神経原性またはタウのもつれに結合します, パーキンソン病のアルファシヌクレイン, ハンチントン病の変異ハンチントンのタンパク質.パンチャナン・マイティとの手順を実証するのは、大学院生のザッカリー・バウワーズと、私の研究室の研究科学者アレクサンドラ・プレモンズです。麻酔後12ヶ月のアルツハイマー病モデルマウスでの疼痛反射への応答の欠如を確認した後、手術トレイの上の位置にマウスを置き、腹部と横隔膜を通して切開を行う。
21ゲージの灌流針を切開に挿入し、右耳通りに小さな切開を行い、灌流液が体内から排出されるようにします。重力供給灌流システムを使用して、氷冷0.1モルPBS流体が毎分20〜25ミリリットルの流量で5〜6分間針に流れ込むことを可能にする。灌流が正しく行われれば、明確な肝臓が観察される。
血液が完全に除去されない場合、クルクミンは血管に結合し、緑色の蛍光背景信号を生じる可能性があるため、適切な動物の灌流が不可欠です。すべてのPBSが配信されたら、バッファーバルブを氷冷4%パラホルムアルデヒド溶液に8〜10分間切り替えてから、はさみと鉗子を使用して頭蓋骨から脳を解放します。その後、ヘラを使用して、処理するまで摂氏4度の貯蔵のための組織体積の少なくとも10倍の4%パラホルムアルデヒドのバイアルに脳を配置します。
クライオスタット断法のセクションを得るために、摂氏22度のクライオスタットを使用して40マイクロメートルのセクションを得る前に、1濃度あたり24時間4度の段階的なショ糖溶液に脳を順次浸漬し、0.02%アジドで補うPBSを含む6つのウェルプレートに1ウェルあたり10〜20セクションを配置する。すべてのサンプルを取得したら、さらに処理するまで4°Cでセクションを保管してください。パラフィン切片の切片を得るために、濃度あたり2時間連続的に等級アルコール溶液を有する後固定パーフューズド脳組織を脱水し、続いて室温で1時間100%アルコール浸漬2回、1時間のキシレン浸漬を2回行う。
最後のキシレン浸漬後、アルミニウム箔で覆われたガラス円錐形ガラスで摂氏56度で1回1~1キシレン溶液をパラフィン溶液に2回、4〜6時間浸透させる。インキュベーションの終わりに、室温で回転式ミクロトームを使用して、45°Cの組織水浴にセクションを配置する5マイクロメートルの厚いセクションを得る。クライオスタット組織切片におけるアミロイドベータプラークのクルクミン標識の場合、PBSで切片を洗浄1回5分間3回リンスしてから、70%エタノールに分を室温で2分間浸漬します。
切片がインキュベートしている間、ストッククルクミンの1ミリモルをメタノールで溶解し、70%エタノールで10マイクロモルの最終的な作業濃度に溶液を希釈する。インキュベーションの終了時に、1分間に50回転で室温で10分間、作業クルクミン溶液にセクションを浸します。染色期間の終わりに、クルクミン溶液を捨て、70%エタノールで3回の2分間の洗浄でセクションを洗浄します。
最後の洗浄後、セクションをポリリシンコーティングガラススライドに移し、適切な有機実装媒体を使用してカバースリップを各スライドに取り付けます。その後、10または20xの目的と適切な励起および放出フィルタを使用して、蛍光顕微鏡上のセクションを表示します。深いパラフィン化された組織切片の組織化学的標識の場合、5マイクロメートルの厚い切片を浸漬1回の室温で5分間、次に1分間のアルコール溶液浸漬で水分補給を行います。
インキュベーションの最後に、濃度あたり2分間、等級アルコール溶液でセクションを洗浄し、続いて2つの5分間のキシレン浸漬でクリアします。2番目のキシレン浸漬後、各セクションを顕微鏡スライドに取り付け、蓋スリップと蛍光顕微鏡イメージング用の適切な実装媒体を使用します。抗A-β抗体によるクライオスタットセクション標本の標識の場合、PBSで10%正常なヤギ血清、室温で1時間0.5%トリトンx-100の非特異的結合を遮断する前に、12ウェルプレートの個々のウェルで1回の洗浄ごとに新鮮なPBSでサンプルを3回洗浄します。
インキュベーションの終了時に、ブロッキング溶液を廃棄し、1分間に摂氏4度と150回転で一晩a-β特異的抗体でサンプルをインキュベートします。翌朝、1回の洗浄ごとに新鮮なPBSで3回の10分間の洗浄で切片を洗浄し、続いて赤いフルオロフォアと共役した適切な二次抗体を光から保護した室温で1時間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに、PBSでセクションを3回洗い、続いて70%アルコールで1回洗浄します。
アルコール洗浄後、10マイクロモルクルクミンを室温で10分間インキュベートし、その後3回1分間70%アルコール洗浄を行います。最後の洗浄後、90%と100%アルコールで濃度1分間脱水し、インキュベーションごとに新鮮なキシレンで浸漬ごとに5分間セクションを2回クリアします。次に、説明したようにセクションをマウントしてイメージします。
細胞内アミロイドβ共局在化の場合、抗アミロイドベータ抗体でセクションを染色し、続いて室温でクルクミンを染色し、光から保護された毎分50回転を行います。インキュベーションの終わりには、適切な核染料を用いて、室温で10分間、1分間に50回転の光から保護し、続いてPBSで3回の洗剤を行う。次に、示すように蛍光顕微鏡でセクションをマウントして画像化します。
クルクミンによるインキュベーション時間を増加させるとAベータプラークの蛍光強度がわずかに増加するが、観察されたプラークの数は1分と5分間の染色時間の間で有意に異ならない。クルクミンは、ベータプラークおよび凍結切除、パラフィン埋め込み、およびヒトアルツハイマー病組織サンプルを染色するために使用することができる。クルクミン染色前にβ特異的抗体と標識すると、クルクミンが抗体を結合する同じプラークでAベータと完全に共局化することが明らかになる。
ベータオリゴマーとラベル付けされたクルクミンで染色した後、オリゴマーとのクルクミン共局在化はAベータプラークで観察することができる。同様に、クルクミンはまた、細胞内空間におけるAβ特異的抗体と共局化し、その染色が細胞内Aベータに標識できることを確認する。クルクミン標識はまた、従来のアミロイド結合色素よりも顕著である。
タメリック抽出物に見られるクルクミン誘導体は、使用される取り付け培地の種類に関係なく、ヒトアルツハイマー病の脳組織におけるクルクミンに比較的βプラークをラベルします。また、クルクミン免疫蛍光シグナルや反染色強度は、典型的な核染色や他の細胞マーカーで染色した後も維持されます。私たちは、定数セクションが40ミクロンよりも薄くする必要があることを見た。
このトレーニング手順は30分以下に保つ必要があり、最適なクルクミン濃度は1〜2マイクロモルです。二重レベリング遅滞バイオマーカーは、同じ組織上で行うことができるし、脳細胞のレベル化されている脳細胞の大きな特異性を提供することができます.クルクミンがアミロイドプラークの負荷を軽減できることを考えると、このプロセスがどのように起こるかの正確なメカニズムは、現在、細胞レベルと分子レベルの両方で調査されています。
