小コロニー変異体またはSCV技術は、緑膿菌の小コロニー変異体の選択および成長を可能にする。この方法は非常に決定的であり、通常の方法よりも簡単に選択できます。このプロトコルはまた、標準的なウロン酸カルバゾール法と比較して、より安全で、より敏感なELISA定量法を詳述し、焼灼またはサンプル操作を行わずにサンプル中の直接アルギン酸定量を可能にする。
この手順のデモンストレーションは、ラボ技術者のブランドン・カービーと、私の研究室の大学院生であるロイ・アル・アフマーです。小コロニー変異体またはSCVを検出するために、最初にP.aeruginosa株PAO1デルタPYRDを事前に温められたPIAプレートにストリークする。48時間摂氏37度で株を成長させます。
成長プレート上で、通常の3〜5ミリメートルのコロニーサイズとは対照的に、1〜3ミリメートルのコロニーサイズを特徴とするSCV表現型を有する単一コロニー分離株を同定する。選択したコロニーを再ストリークして、SCVの純粋な分離物を得る。サルベージ経路の生理的活性化を行うために、滅菌接種ループを使用してPIAプレートからSCVコロニーをピックする。
選択したコロニーを、0.1ミリモルウラシルを補った事前に温めたPIAプレートに付ける。24〜48時間摂氏37度でプレートを成長させます。ウロン酸カルバゾールアッセイを開始するには、試験対象の株の純粋な培養物から単一コロニーを同定し、滅菌爪楊枝を使用してコロニーを選ぶ。
5ミリリットルのPIBを含む培養試験管に爪楊枝を入れる。24時間摂氏37度でシェーカーインキュベーターで成長します。インキュベーションに続いて、培養PIBスープのアリコートを事前に温めたPIAプレートに加えます。
無菌細胞スプレッダーを使用して、プレート上にスープを広げ、24時間摂氏37度で成長させます。ピペットコントローラと無菌50ミリリットルピペットを使用して、大人の芝生に0.85%塩化ナトリウムを加え、セルスプレッダーを使用してプレートを削ってサンプルを収集します。新鮮な50ミリリットルピペットを使用してサンプルを吸引し、50ミリリットルの回収管に移す。
サンプルを高く渦を混ぜて混合し、氷の上に置きます。試料のOD600を測定するために、まず0.85%塩化ナトリウムの1ミリリットルを用いて分光光度計をブランクにする。次に、サンプルの1ミリリットルを新しい使い捨てキュベットに加え、ODを読み取ります。この手順を 2 回繰り返して、サンプルごとに読み取りの三重を取得します。
硫酸ホウ酸溶液を培養管に3ミリリットル加え、氷の上に座らせます。採取したサンプルの350マイクロリットルを試験管の酸混合物にゆっくりと加えます。低い上で短時間ボルテックスした後、酸サンプル混合物に0.1%カルバゾールとエタノール溶液の100マイクロリットルを加えます。
中程度の設定にチューブと渦を5秒間キャップします。その後、30分間摂氏55度の乾燥した風呂に入れます。インキュベーションの後、チューブを一時的に高く渦を出し、5分間冷却します。
分光光度計にブランクとして0.85%塩化ナトリウムを有するチューブを使用してください。その後、混合物の1ミリリットルをきれいなキュベットに加え、分光光度計で530ナノメートルのサンプルのODを読み取ります。既知濃度のd-マンロン酸のOD530の連続希釈を測定して標準曲線を調製する。
2回繰り返し、これらの測定値から線形方程式を抽出します。標準曲線を用いて各試料中のアルギン酸塩の濃度を計算し、OD600で直鎖式からアルギン酸濃度を割り出し、OD600当たりのアルギン酸の総量を求める。マイクロピペットを使用して、回収したサンプルの50マイクロリットルを未処理の96ウェルプレートに加えます。
その後、ウェルにELISAコーティングバッファーの50マイクロリットルを追加します。プレートを摂氏37度で2時間インキュベートします。ホヤボトルを使用して、井戸を充填し、プレートをひっくり返してそれらを排出することによってPBS-Tでプレートウェルを2回洗います。
マイクロピペットでウェルに200マイクロブロッキングバッファーを加え、一晩で摂氏4度でインキュベートします。翌日、皿を前のようにPBS-Tで2回洗います。その後、希釈された一次抗体の100マイクロリットルを井戸に加え、摂氏37度で1〜2時間インキュベートします。
インキュベーションに続き、プレートウェルを以前のようにPBS-Tで3回洗浄します。次に、希釈した二次抗体を100マイクロリットルのウェルに加え、摂氏37度で1~2時間インキュベートします。プレートを再度3回洗浄した後、マイクロピペットを使用して100マイクロリットルのTMB ELISA溶液を添加する。
プレートを引き出しに入れるか、ホイルで包むことによって、暗闇の中で30分間室温でプレートをインキュベートします。その後、100マイクロリットルのストップ溶液を加えます。プレートリーダーを使用して、450ナノメートルでODを測定します。
既知濃度のd-マンロン酸の直列希釈液のOD450を測定することにより、標準曲線を生成します。測定を2回繰り返し、線形方程式を抽出します。標準曲線を用いて各試料中のアルギン酸塩の濃度を計算し、その線形方程式からアルギン酸濃度をOD600で割って、OD600当たりのアルギン酸の総量を求める。
ここに示されているのは、PIAおよびPIAで成長したピリミジン・デ・ノボ生合成を調節する遺伝子の突然変異を伴うPAO581およびPAO581のサンプルであり、ウラシルの0.1ミリモルを補った。データは、媒体中のウラシルの存在が、復元されたアルギン酸生産によって見られるように変異株を粘膜に戻すことを示している。ここで、抗アルギン酸モノクローナル抗体ベースELISAに関する結果が示されている。
コロニーは、PBADプロモーターおよびpHERD-20Tプラスミドの誘導のためにアラビノースを有するPIAプレート上で成長する。示されているPAO1、PAO1は、主要なアルギン酸特異的シグマ因子algUを有する発現プラスミドpHERD-20T、および主要なアルギン酸生合成酵素GDP-マンノース脱水素酵素をコードする際のalgD遺伝子のフレーム内欠失を有するPAO1である。このデータは、PAO1およびPAO1デルタalgDについて測定されたアルギネートの非粘液レベルと、PHERD-20T algUとPAO1について測定されたアルギネートの粘液レベルを比較する。
抗アルギン酸ELISAは、プレート上での事前成長を伴わない患者痰サンプルでも試験した。粘膜P.aeruginosaの成長を有する3つのCF痰サンプルは、非粘液P.aeruginoaまたはP.aeruginosa成長を含む2つの患者痰サンプルと比較して検出可能なアルギン酸塩を示した。アルギン酸定量のための標準曲線の調製は、サンプル内のアルギン酸塩の正確かつ正確な測定を可能にするため、非常に重要です。
カルバゾール法で使用される酸溶液は非常に危険であるため、適切な個人用保護具と予防措置を使用して安全性を確保する必要があります。SCVを単離した後、さらに遺伝子プロファイリングを行い、発生する突然変異およびそのような突然変異に関連する病原性をよりよく理解することができる。ELISA法は嚢胞性線維症の患者の慢性肺感染をモニターするように適合することができる。
さらに、我々の成長方法は、特定のSCVによって引き起こされる感染症を診断するのに役立つ可能性がある。
