このプロトコルは、シュードモナス緑膿菌群のタイムラプス映画を生成し、バクテリオファージまたは抗生物質による群れの反発を捕捉するために使用することができる。タイムラプス映画は、抗生物質とバクテリオファージに対する群れの反応の詳細なダイナミクスを捉え、この技術は除湿機、コンピュータ、インキュベーター、およびドキュメントスキャナのみを必要とします。P.aeruginosaの群れのタイムラプスイメージングのための群れの寒天プレートを準備するには、25ミリリットルのピペットを使用して、各実験用直径10センチメートルのペトリ皿に20ミリリットルの群れの寒天溶液を加えます。
プレートを蓋付きの単一のスタックに室温で1時間置きます。除湿機をオンにして部屋の相対湿度を40~50%に下げ、寒天が固まったら、ふたをオフにして層状のフローフードでさらに30分間乾燥させ、室温で40〜50%の相対湿度で毎分300立方フィートで顔を上げます。その後、乾燥した群れの寒天プレートを摂氏4度で最大24時間保管します。
群がる寒天メッキの場合は、一晩のP.aeruginosa培養物から5マイクロリットルを積んだP20ピペットチップを、1つの群れプレートの中心から2〜1/2センチメートル上の10-45度の角度で保持し、プランジャーを液体滴だけで寒天に触れる最初の停止まで落ち込みます。テンプレートを使用して、異なる群れの寒天プレートに一貫してスポットを配置します。ファージ感染をプレートするには、最初に10倍の10倍の6マイクロリットルを持つ一晩培養P.aeruginoaの30マイクロリットルをファージDMS3 virのミリリットル当たり12個のプラーク形成単位と混合し、すぐに2.8センチメートル半径半径コンコンサークル上の6つの等距離位置にP.aeruginoaファージの6マイクロリットルを加える。
テンプレートを使用して、異なる群れの寒天プレートに一貫してスポットを配置します。抗生物質治療をプレートするには、一晩培養したP.aeruginosaの30マイクロリットルを目的の抗生物質の適切な濃度と体積と混合し、すぐに皿の中心の周りの半径2.8センチメートルの同心円上の6つの等距離衛星位置に抗生物質処理細菌の6マイクロリットルを追加する。テンプレートを使用して、異なる群れの寒天プレートに一貫してスポットを配置します。
すべての文化がメッキされたら、透明なペトリ皿の蓋をカスタムメイドの黒いふたに置き換えます。慎重に10リットルの水浴で摂氏37度に設定されたインキュベーターでスキャナーに群がる寒天プレートを置き、湿度を75%に保ち、プレートをスキャナに入れて保存し、画像の保存パスを設定して保存し、30分間隔でスキャンしてOKをクリックします。画像の取得を自動化するには、スクリプト ソフトウェアを使用します。
アイドルスキャンとシングルスキャンの両方を選択し、アイドルスキャンを右クリックして、有効にして左クリックします。インキュベーションの最後に、スキャンした画像をすべて ImageJ にインポートします。シーケンスオプションウィンドウでは、画像の数は選択した画像の数を示します。
イメージの最初の画像から開始する 100% で、イメージの元のサイズを節約するために 100% で画像を開始します。画像を色で保つには、RGB に隠しをクリックします。[仮想スタックを使用] をオフのままにし、[OK] をクリックしてイメージを読み込みます。
ファイルをクリックし、AVI として保存し、AVI ファイルにイメージをマージします。圧縮を JPEG に、フレーム レートを 1 秒あたり 5 フレームに調整します。次に、AVI のタイムラプスを適切なストレージ フォルダーに保存します。
LBスープのLB寒天プレートからの野生型P.aeruginosaの単一コロニーのタイムラプスイメージングは、一晩37度でLBスープの中に発見され、群れの寒天板の中心に発見され、コロニーから放射状に腱に広がるプレートの中心にあるコロニーの形で最初の成長を明らかにする。群れは群がる寒天プレートの中心から周辺に移動し、ファージに感染した細菌またはゲンタマイシンで処理された細菌によって放出されるストレス信号によって撃退される。衛星位置で単独で発見されたファージやゲンタマイシンは、これらの地域を避けるために群れの集団を引き起こしません。
25ミリリットルのピペットを使用して、群れの寒天プレートに正確に20ミリリットルが含まれていることを確認してください。また、実験室環境に合わせてプレートの乾燥時間を調整することも重要です。この技術により、緑膿菌集団の全体的な群れのパターンを可視化することができます。
次の目的は、ブライトフィールド顕微鏡を用いて個々の細胞運動を監視することです。
