Ce protocole utilise l’analyse histologique pour obtenir des mesures morphométriques robustes des blessures excisionales de souris. En utilisant cette technique, nous pouvons analyser l’ensemble de la plaie à l’aide d’un sous-ensemble de sections en série, ce qui nous permet de détecter plus précisément les défauts qui pourraient autrement être manqués. Lindsey Rhea, associée de recherche de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale chez une souris adulte anesthésiée, appliquez de la pommade sur les yeux de l’animal et utilisez une tondeuse à rasoir électrique dans un mouvement caudal-rostral pour enlever la fourrure sur le dos de la souris au niveau des épaules. Utilisez une lame de rasoir tenue à un angle de 20 degrés de l’arrière dans un mouvement rostral-caudal pour enlever tous les cheveux restants de la peau exposée, puis nettoyez la peau avec un iode povidone et un 70% isopropyl alcool préparation pad essuyer. Pour l’induction des plaies, drapez une serviette propre à base de papier sur une surface plane recouverte de cire dentaire et placez la souris sur la serviette en position couchée.
Pincez la peau de la souris entre les omoplates le long de la ligne médiane dorsale et tirez le pli de la peau en sandwich loin du corps. En changeant la souris en position couchée latéralement, placez un poinçon de biopsie de la taille désirée de la plaie aussi près que possible du corps et laissez la peau se détendre. Appuyez sur le poinçon à l’aide d’un mouvement de bascule pour percer toutes les couches de la peau et enlever les biopsies de poinçon de la plaie à l’aide de ciseaux stériles et pinces à épiler pour libérer le punch de la peau environnante si nécessaire.
Ensuite, laissez la souris récupérer avec la surveillance et l’analgésie. Pour l’analyse morphométrique du lit de plaie, ouvrez une image numérique tachée de blessure. Pour définir l’échelle et les préférences de mesure, sous Analyser, sélectionnez l’échelle définie et entrez la distance en pixels, la distance connue et l’unité de longueur.
Sélectionnez Global et OK pour garder l’échelle la même pour chaque image ouverte et sélectionnez Analyser et définir les mesures pour confirmer que la zone est cochée. Pour mesurer la longueur de la plaie, sélectionnez à main levée, et utilisez l’outil pour tracer le long de la jonction cutanée-épidermique, à partir du dernier follicule pileux du tissu non blessé d’un côté de la plaie au premier follicule pileux du tissu non blessé de l’autre côté. Si l’épiderme ne couvre pas toute la plaie, suivez la jonction cutanée-épidermique d’un côté de la plaie où la langue migrante se termine et continuez à suivre l’aspect supérieur du tissu granulation ou la jonction entre le tissu granulé et la tavelure jusqu’à ce que la langue migrante et le premier follicule pileux du tissu non blessé de l’autre côté de la plaie soient atteints.
Cliquez ensuite Analyser et mesurer. La longueur de la mesure apparaîtra dans les mêmes unités que dans l’échelle. Si l’épiderme ne couvre pas toute la plaie, mesurer la distance entre chaque bord d’attaque épidermique suivant l’aspect supérieur du tissu granulation ou la jonction entre le tissu granulation et la tavelure au premier follicule pileux.
Pour mesurer la zone de la plaie, utilisez l’outil à main levée pour tracer le long de l’aspect supérieur de l’épiderme ou l’aspect supérieur du tissu granulation à partir du dernier follicule pileux du tissu non blessé d’un côté de la plaie au premier follicule pileux du tissu non blessé de l’autre côté. Continuer à tracer verticalement le long du follicule pileux dans le tissu de granulation. Une fois que le follicule pileux opposé et le tissu ou le muscle adipeux sont atteints, suivez la bordure inférieure du tissu de granulation de l’autre côté de la plaie et rejoignez le point de départ le long du follicule pileux pour fermer la zone.
Si la plaie n’est pas entièrement épithélialisée, tracez l’aspect supérieur de l’épiderme jusqu’au bord d’attaque et retournez au point de départ suivant la jonction cutanée-épidermique. Comme illustré, lors de la prise de mesures 2D dans toute la plaie, nous avons été en mesure de calculer les paramètres non possibles avec l’analyse 2D sur le milieu de la plaie seulement, qui est une méthode couramment utilisée dans le domaine. Dans cette expérience, des mesures 2D de la zone de blessure ont été employées et moyennes au-dessus de la blessure entière ou d’un sous-ensemble moyen de la blessure et n’ont indiqué aucune différence significative entre les groupes expérimentaux ou les méthodes d’analyse.
Le volume calculé de blessure, cependant, était sensiblement différent entre les groupes expérimentaux, démontrant l’importance d’une analyse histologique en profondeur des paramètres de guérison de blessure. Il est essentiel de générer des plaies de taille constante pour l’analyse histologique et d’effectuer des sections périodiques rigoureuses pour une analyse morphométrique précise. Les sections non tachées peuvent être utilisées pour l’immunofluorescence ou la coloration trichrome de Masson pour mesurer d’autres aspects de la cicatrisation des plaies, tandis que les plaies congelées flash peuvent être utilisées parallèlement à la morphométrie pour l’analyse quantitative des protéines.
