Este protocolo usa análise histológica para obter medidas morfométricas robustas de feridas excisionais de camundongos. Usando esta técnica, podemos analisar toda a ferida usando um subconjunto de seções seriais, permitindo-nos detectar com mais precisão defeitos que poderiam ser perdidos de outra forma. Demonstrando o procedimento será Lindsey Rhea, uma pesquisadora associada do meu laboratório.
Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal em um rato adulto anestesiado, aplique pomada aos olhos do animal e use um cortador de navalha elétrico em um movimento caudal-rostral para remover a pele na parte de trás do mouse no nível do ombro. Use uma lâmina de barbear presa em um ângulo de 20 graus da parte de trás em um movimento rostral-caudal para remover qualquer cabelo restante da pele exposta, em seguida, limpe a pele com um iodo povidone e um limpador de almofada de preparação de álcool isopropílico de 70%. Para a indução da ferida, coloque uma toalha limpa à base de papel em uma superfície plana coberta com cera dentária e posicione o rato sobre a toalha na posição propensa.
Aperte a pele do rato entre as omoplatas ao longo da linha dorsal e puxe a dobra da pele sanduíche para longe do corpo. Mudando o mouse para uma posição lateral, coloque um soco de biópsia do tamanho da ferida desejada o mais próximo possível do corpo e deixe a pele relaxar. Pressione o soco usando um movimento de balanço para perfurar todas as camadas da pele e remova as biópsias de socos da ferida usando tesouras e pinças estéreis para libertar o soco da pele circundante, conforme necessário.
Em seguida, deixe o mouse se recuperar com monitoramento e analgesia. Para análise morfométrica do leito da ferida, abra uma imagem digital manchada. Para definir as preferências de escala e medição, em Analisar, selecione Definir escala e digite a distância em pixels, a distância conhecida e a unidade de comprimento.
Selecione Global e OK para manter a escala a mesma para cada imagem aberta e selecione Analisar e Definir Medidas para confirmar se a caixa de área está verificada. Para medir o comprimento da ferida, selecione à mão livre e use a ferramenta para rastrear ao longo da junção dérmico-epidérmico, desde o último folículo piloso do tecido não ferido de um lado da ferida até o primeiro folículo piloso do tecido não ferido do outro lado. Se a epiderme não cobrir toda a ferida, siga a junção dérmico-epidérmico de um lado da ferida onde a língua migratória termina e continue seguindo o aspecto superior do tecido de granulação ou a junção entre o tecido de granulação e a cicatriz até que a língua migratória e o primeiro folículo piloso do tecido ileso do outro lado da ferida sejam atingidos.
Em seguida, clique em Analisar e Medir. O comprimento da medição aparecerá nas mesmas unidades definidas na escala. Se a epiderme não cobrir toda a ferida, meça a distância entre cada borda epidérmica seguindo o aspecto superior do tecido de granulação ou a junção entre o tecido de granulação e a cicatriz até o primeiro folículo piloso.
Para medir a área da ferida, use a ferramenta à mão livre para traçar ao longo do aspecto superior da epiderme ou o aspecto superior do tecido de granulação a partir do último folículo piloso do tecido ileso de um lado da ferida até o primeiro folículo piloso do tecido não ferido do outro lado. Continue a traçar verticalmente ao longo do folículo piloso no tecido de granulação. Uma vez alcançado o folículo piloso oposto e o tecido adiposo ou o músculo, siga a borda inferior do tecido de granulação até o lado oposto da ferida e junte-se ao ponto de partida ao longo do folículo piloso para fechar a área.
Se a ferida não for totalmente epitelializada, rastreie ao longo do aspecto superior da epiderme até a borda principal e retorne ao ponto de partida após a junção dérmico-epidérmico. Como ilustrado, ao tomar medições 2D em toda a ferida, pudemos calcular parâmetros não possíveis com análise 2D apenas no meio da ferida, que é um método comumente utilizado no campo. Neste experimento, foram utilizadas medidas 2D da área da ferida e mediadas sobre toda a ferida ou um subconjunto médio da ferida e não revelaram diferença significativa entre grupos experimentais ou os métodos de análise.
O volume calculado da ferida, no entanto, foi significativamente diferente entre os grupos experimentais, demonstrando a importância de uma análise histológica aprofundada dos parâmetros de cicatrização das feridas. Gerar feridas consistentemente dimensionadas para análise histológica e realizar seção serial rigorosa são fundamentais para uma análise morfométrica precisa. Seções não manchadas podem ser usadas para imunofluorescência ou coloração tricromática de Masson para medir outros aspectos da cicatrização de feridas, enquanto feridas congeladas podem ser usadas ao lado da morfometria para análise quantitativa de proteínas.
