Этот протокол использует гистологический анализ для получения надежных морфометрических измерений эксциозных ран мыши. Используя этот метод, мы можем проанализировать всю рану с помощью подмножества серийных разделов, что позволяет нам более точно обнаружить дефекты, которые в противном случае могли бы быть пропущены. Демонстрацией процедуры будет Линдси Рея, научный сотрудник из моей лаборатории.
Подтвердив отсутствие реакции на педаль рефлекса в анестезированные взрослые мыши, применить мазь к глазам животного и использовать электрический клипер бритвы в каудал-ростральное движение, чтобы удалить мех на задней части мыши на уровне плеча. Используйте лезвие бритвы, состоявшейся под углом 20 градусов со спины в рострал-каудальное движение, чтобы удалить все оставшиеся волосы из открытой кожи, а затем очистить кожу с одним йодом povidone и один 70%isopropyl алкоголя prep pad протрите. Для индукции раны, драпировка чистой бумажной основе полотенце на плоскую поверхность, покрытую зубным воском и положение мыши на полотенце в положении склонны.
Pinch кожи мыши между лопатками вдоль спинной средней линии и вытащить зажатой кожи сложить от тела. Переключение мыши в боковое положение, место биопсии удар желаемого размера раны как можно ближе к телу, как это возможно и позволить коже расслабиться. Нажмите на удар с помощью качания движения, чтобы проколоть все слои кожи и удалить пунш биопсии из раны с помощью стерильных ножниц и пинцета, чтобы освободить удар из окружающей кожи по мере необходимости.
Затем позвольте мыши восстановиться с помощью мониторинга и анальгезии. Для морфометрического анализа раны кровать, открыть цифровое окрашенные раны изображения. Чтобы установить настройки масштаба и измерения, в соответствии с анализом, выберите Set Scale и введите расстояние в пикселях, известное расстояние и единицу длины.
Выберите Global и OK, чтобы сохранить шкалу одинаковой для каждого открытого изображения и выберите анализ и набор измерений, чтобы подтвердить, что поле области проверено. Чтобы измерить длину раны, выберите от руки, и использовать инструмент для отслеживания вдоль дермальной эпидермальной связи, начиная с последнего волосяного фолликула невредимой ткани на одной стороне раны до первого волосяного фолликула невредимой ткани с другой стороны. Если эпидермис не покрывает всю рану, следуйте за дермальной эпидермальной развязкой на одной стороне раны, где заканчивается мигрирующий язык, и продолжайте следовать превосходному аспекту грануляционной ткани или стыку между гранулированной тканью и парши до тех пор, пока не будет достигнут мигрирующий язык и первый волосяной фолликул невредимой ткани по другую сторону раны.
Затем нажмите Анализ и измерения. Длина измерения будет отображаться в тех же единицах, что и в шкале. Если эпидермис не покрывает всю рану, измерьте расстояние между каждым эпидермальным передним краем, следуя за превосходным аспектом гранулированной ткани или соединением между гранулированной тканью и парши до первого волосяного фолликула.
Для измерения области раны используйте инструмент от руки, чтобы проследить по превосходному аспекту эпидермиса или превосходный аспект гранулированной ткани, начиная с последнего волосяного фолликула невредимой ткани с одной стороны раны до первого волосяного фолликула невредимой ткани с другой стороны. Продолжайте отслеживать вертикально вдоль волосяного фолликула в грануляционную ткань. Как только противоположный волосяной фолликул и жировой ткани или мышцы достигли, следуйте нижней границе гранулированной ткани на противоположную сторону раны и присоединиться к отправной точке вдоль волосяного фолликула, чтобы закрыть область.
Если рана не полностью эпителиализирована, проследите по превосходному аспекту эпидермиса до ведущего края и вернитесь к исходной точке после дермально-эпидермального соединения. Как показано на примере, при принятии 2D измерений по всей ране, мы смогли вычислить параметры не возможно с 2D-анализа на середине раны только, который является широко используемым методом в поле. В этом эксперименте были использованы 2D измерения области раны и усредлены по всей ране или среднему подмножество раны и не выявили существенной разницы между экспериментальными группами или методами анализа.
Однако рассчитанный объем ран значительно отличался между экспериментальными группами, демонстрируя важность углубленного гистологического анализа параметров заживления ран. Создание последовательно размера ран для гистологического анализа и выполнения строгих серийных секций имеют решающее значение для точного морфометрического анализа. Необложечные секции могут быть использованы для иммунофторесценции или трихромного окрашивания Массона для измерения других аспектов заживления ран, в то время как флэш-замороженные раны могут быть использованы наряду с морфометрией для количественного анализа белка.
