このプロトコルは、C.elegansニューロンにおける樹状突起スパインの形態とカルシウム過渡現象を視覚化する方法を説明しています。私たちのアプローチは、脊椎の形態形成と機能の決定要因を発見するための遺伝的アプローチを促進するはずです。私たちのプロトコルは、GABA作動性ニューロンの樹状突起棘を特徴としています。
C.elegansニューロンの他のクラスの棘もこれらの方法で調査することができます。私たちのプロトコルは、生きているC.エレガンスを固定する方法を説明しています。画像取得中の動物の動きを防ぎ、ニューロン活動を励起して記録するための適切なレーザー構成を選択することが特に重要です。
高解像度の画像を取得するには、3マイクロリットルの麻酔液を追加し、10%アガロースパッドに15〜20匹の若い成虫を投与します。次に、カバーガラスを適用してワームを固定し、溶けた接着剤シーラント混合物でカバーガラスの端をシールします。超解像取得には、超解像顕微鏡を搭載したレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用します。
メーカーのソフトウェアが推奨するステップサイズを使用してZスタックを取得します。背側DまたはDD腹側突起の総体積にまたがる一連の光学切片を収集します。メーカーのソフトウェアを使用して画像処理のためにZスタックを提出し、7以上のスコアで画像を分析します。
ナイキスト取得には、レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用し、光の波長と対物レンズの開口数に最適なピクセルサイズを選択します。次に、自動アルゴリズムを使用して3Dデコンボリューションのスタックを送信します。画像解析には、適切な画像処理ソフトウェアを使用して、Zスタックの最大強度投影を作成します。
そして、DD樹状突起の突起を手動で数えます。次に、刻み目されたDD樹状突起の長さを決定し、DD樹状突起10マイクロメートルあたりの棘の密度を計算します。次に、棘を細いまたはキノコ、糸状、ずんぐりした、または分岐したものとして分類します。
マイクロインジェクションなどの従来の技術を使用して、DDニューロンのカルシウムセンサーGCaMPを発現するトランスジェニックワームと、シナプス前VAニューロンの赤方偏移チャネルロドプシンであるクリムゾンを作成します。次に、層流フードの下で、300マイクロリットルの一晩増殖したOP50細菌培養物、および0.25マイクロリットルのATRを各60ミリメートル線虫増殖培地栄養寒天プレートに追加することにより、すべてのトランスレチナールまたはATRプレートを準備します。次に、滅菌ガラス棒で培養物を広げます。
コントロールプレートの場合、300マイクロリットルのOP50バクテリアと0.25マイクロリットルのエタノールを追加します。細菌の増殖を可能にするために、周囲光から保護された室温で24時間プレートをインキュベートします。実験を設定するには、5匹のL4ステージ幼虫をOP50シードATRまたはコントロールプレートに置き、プレートを摂氏23度の暗所でインキュベートします。
3日後、ステレオ解剖顕微鏡を使用して外陰部の発達を確認し、ATRとコントロールプレートからL4ステージの子孫を選択してイメージングします。次に、2マイクロリットルの0.05マイクロメートルのポリビーズを顕微鏡スライド上に置きます。そして、約10匹のL4幼虫を溶液に入れます。
白金線を使用して、瞬間接着剤の小さな小球を溶液に追加します。溶液を穏やかに回転させて、接着剤の糸状のストランドを生成します。次に、3マイクロリットルのM9バッファーを追加します。
次に、カバースリップを適用し、前述のようにその端をシールします。樹状突起スパインの誘発カルシウム過渡現象を記録するには、スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用し、顕微鏡ステージを調整してDDスパインを焦点面に配置します。次に、タイムラプス取得を設定して、GCaMP蛍光を検出するためにすべてのフレームに488ナノメートルのレーザーラインを、クリムゾン励起用に561ナノメートルのレーザーラインでサンプルを一定間隔で照らします。
in vivoカルシウムイメージングでは、2Dデコンボリューションと画像アライメントを使用して、取得中のワームの動きからのわずかな偏差を修正します。次に、DD樹状突起スパインを関心領域またはROIとして定義します。ROIを複製し、ワーム内の隣接する領域に再配置して、バックグラウンド信号を収集します。
次に、適切なソフトウェアを使用して、各時点のGFP強度をExcelにエクスポートし、スパインROI蛍光からバックグラウンド蛍光を差し引きます。励起後の各時点から561ナノメートル励起直前またはゼロでのフレーム内のGFP蛍光を差し引くことによって蛍光の変化を決定し、次にFゼロで除算してFゼロ上のデルタFを決定します。そして、正規化されたトレースをグラフ化します。
まず、シャピロ・ウィルク検定を使用してデータが正規分布しているかどうかを判断します。正規分布していないデータの場合は、複数の検定に対して事後補正付きのノンパラメトリック分散分析を使用します。あるいは、正規分布またはガウス分布を示す測定については、各561ナノメートルパルス前後のGCaMP蛍光の各測定について対応のあるパラメトリックANOVA検定を実行します。
そして、2つのグループのそれぞれの多重比較を修正します。DD樹状突起スパインを3つの独立したマーカー、細胞質mCherry、MYR:mRuby、およびLifeAct:GFPで標識すると、野生型の若年成人でDD樹状突起10ミクロンあたり平均3.4 DD樹状突起スパインが得られた。GFP:Utrophinマーカーは、おそらくウトロフィンと脊椎の形態形成を促進するアクチン細胞骨格との相互作用が原因で、有意に低い脊椎密度をもたらしたため、この分析から除外されました。
生細胞イメージングアプローチにより、DDスパインの薄いキノコ形状の形態が、フィロポディアル、スタビー、分岐などの代替スパイン形状と比較して、成人で優勢であることが確認されました。DD樹状突起スパインの活性化は、DDニューロンでGCaMPを発現するトランスジェニック線虫のシナプス前コリン作動性シグナル伝達、およびシナプス前VAニューロンのクリムゾンによって評価されました。GCaMPシグナルの一時的なバーストは、シナプス前VAニューロンにおけるクリムゾンの光遺伝学的活性化の直後にDDスパインで検出されました。
ATRの非存在下での対照実験では、GCaMPシグナルの測定が厳密にATR依存性であるクリムゾンの光遺伝学的活性化に依存することが確認された。DDの棘を視覚化するには、突き出た棘が光路に対して直角であるなど、横向きに横たわっている動物を画像化するのが最善です。この方法では、科学者は薬理学的操作を使用して、DDスパインのカルシウム過渡現象を引き起こすメカニズムを理解することもできます。
