この研究は、オーストラリア研究評議会先端分子イメージング優秀センター(CE140100011)(http://www.imagingcoe.org/)によって支援されました。この研究は、ANSTOの一部であるオーストラリアのシンクロトロンでMX2ビームラインを使用して部分的に行われ、オーストラリア癌研究財団(ACRF)検出器を利用しました。

ガラス注射器を用いた高粘性媒体中の結晶の調製
<ol><li>結晶液を静かに遠心分離し(〜1,000xg、22°Cで〜10分)軟質結晶ペレットを形成し、余分な緩衝液を除去する。 これにより、ペレット中の結晶が高濃度になり、データ収集に使用できます。 注:粘性媒体の希釈を防止するために、このステップで結晶濃度を増加させます。各サンプルの結晶体積に対する粘性媒体の比率を最適化し、高い濃度の結晶を得ながら、メディアの高粘度を維持します。遠心分離液は、ペレットを形成し、過剰な緩衝液を除去して溶液中の結晶濃度を増加させる、ダルマニンetに記載されている。al.29.</li>
	<li>カプラーで2つの100 μLのシリンジをセットします。</li>
	<li>最初のスポイトの端までカプラーを締め、28 μLの水晶溶液をシリンジの上部に加えます。ゆっくりと、プランジャーをシリンジの上部に挿入し、溶液をカプラーチップの端まで静かに押し下げ、形成する気泡を取り除きます。この操作を行うには、以下に説明する 2 つの方法のいずれかを実行します。 注: 高粘性媒体に添加される結晶の体積は、サンプル全体の粘度を大きく変えない場合に変化させることができます。<ol>
<li>最初の方法:気泡を破裂させるために急速な圧力変化を使用する。<ol>
<li>慎重に鈍いカプラー針ポイントの上に1つの手袋をした指を置き、(非常に穏やかに)シールを作成するために圧力を加えます。これは、針刺しの損傷につながる可能性があるため、あまりにも多くの圧力を適用しないでください.</li>
			<li>今、針のポイントから離れて溶液を引き出すためにプランジャーを引き戻し、これは注射器の圧力の蓄積を生成します。</li>
			<li>鈍い針先から手袋をした指を取り除くことによって、注射器の上部の圧力を素早く解放します。注意してください, 指を取り除いたときにサンプルが先端に近すぎる場合は、サンプルの損失につながる噴霧可能性があります..シリンジ内の圧力の急激な変化は気泡を破裂させる。すべての泡が削除されるまで繰り返します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>第二の方法:気泡を除去するために「人間の遠心分離機」を使用します。<ol>
<li>注射器を片手に置き、針を上向きにし、プランジャーを2本の指の間にくさび付けして動かないようにします。</li>
			<li>注射器を持つ腕を素早く1方向に2~3回回転させると、サンプル上の遠心力によって、シリンジから気泡が出ます。あまりにもゆっくりと行った場合、サンプルが失われる可能性がありますので、注意してください。</li>
			<li>気泡が残っている場合は、すべての気泡が取り除かれるまで、ステップ1.3.2.1 - 1.3.2.2を繰り返して、気泡のシリンジを検査します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>細かいスパチュラを使用して、2番目のシリンジの上部に直接高真空シリコーングリースの〜42 μLを追加します。プランジャーを最後まで押し下げ、すべての気泡を取り除き、シリンジの端にエアギャップがないことを確認します。 注: シリコーングリースの精密な組成は不活性キャリアとして機能しているので重要ではありません。%gt;10 Pa.sの粘度値または約60:40シリコーングリースと結晶溶液の比は、注入に最適であるが、これはサンプルの正確な特性に応じて変化する可能性がある。シリコーングリースに添加する水溶液の体積を調整し、混合物中の結晶濃度を最適化します。シリコーングリース以外の高粘性メディアは、サンプル30、31、32、33と互換性がある限り使用できます。</li>
	<li>2つのシリンジのいずれにも気泡がないことを確認し、カプラーを使用して注射器を一緒に取り付けます。指から発生する熱のためにシリンジを温めることでサンプルに影響を与える可能性があるため、注射器の端部を握って注射器を垂直に保持します。</li>
	<li>シリコングリースに混ぜ合わせるようにクリスタル溶液側のプランジャーを軽く押してサンプルを混ぜ合わせ、シリコングリース側のプランジャーを押し込み、サンプルをクリスタル溶液側に押し戻します。このプロセスを 50 ~ 100 回繰り返して、サンプルを完全に混合し、均質に見えます。 注:結晶が高粘性媒体(例えば、脂質立方相、LCP)で直接成長する場合、ステップ1.1~1.6は必要ありません。注射器内の結晶を成長させるプロトコルは、劉 et.al で見つけることができます。34、35。このプロトコルに従って、サンプルの統合、ステップ10、すべてのサンプルが1つのシリンジに含まれ、結晶化バッファーが除去されます。このプロトコルでは、7.9MAG の追加は必要ありません。代わりに、注射器に液体が残らなくなるまで、サンプル中のプランジャーを静かに押し下げて、注射器から余分な液体をすべて取り除きます。</li>
	<li>シリンジを通して光学顕微鏡の下で結晶を視覚化するか、最良の結果を得るために、ガラススライドに少量(〜1μL)を抽出し、上部にカバースリップを置きます。</li>
	<li>結晶濃度を確認してください。<ol>
<li>光学顕微鏡画像を用いて特定の領域の結晶数を数えて、シリコーングリース中の結晶濃度を決定します。最良の結果を得るために、高い結晶ヒット率を得るためには、メディア全体に均一に分配される結晶の高密度(>106 の結晶/mL)が理想的です。</li>
		<li>ステップ1.3および1.4で粘性媒体に対する結晶の比率を変更することによって、シリンジの結晶濃度を調整します。<ol>
<li>結晶濃度を下げるには、ステップ1.4でシリコーングリース/HV培地の量を増やすことによって、またはステップ1.1でシリンジを設定する前に結晶ペレットを結晶化緩衝液で溶液中に希釈することによって、シリンジ中の結晶を希釈する。</li>
			<li>結晶濃度を上げるには、ステップ1.4でシリコーングリースの量を減らしますが、10Pa.s以下の粘度を下げないように注意してください。 注:ここで報告された結晶濃度は、この特定のサンプルと結晶サイズに最適化されました。しかし、理想的な結晶濃度は、結晶サイズ、ビームサイズ、針内径(I.D.)、および入射X線フラックスに依存します。これは、最適ヒット率が「良い」と見なされる30%の最適ヒット率から決定できます。実際には、望ましいヒット率を得るためにビーム時間の間に異なるサンプルのために結晶の濃度を最適化する必要があります。高濃度の結晶、109 結晶/mLから始めます。結晶濃度を調整する手順は、劉 et.al で与えられています。35.</li>
		</ol>
</li>
		<li>インジェクタがデータ収集の準備ができるまで、プロトコルはここで一時停止できます。<ol>
<li>結晶がLCPで成長している場合は、それらを密封し、室温で数日間注射器に残るようにします。</li>
			<li>結晶が異なる高粘性媒体(例えば、シリコーングリース)に移された場合、測定の前に、時間の経過に応じ結晶の安定性試験を行う必要があります。これは、不活性メディア内の結晶が安定している時間(理想的には>8時間)とデータ収集の時間制限を決定します。ここで、リゾチームの結晶はシリコーングリース中で何日も安定しており、光学顕微鏡で検査した場合には溶解の兆候を示さなかった。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>カプラーを取り外す前に、すべてのサンプルを 1 つのシリンジに移動します。カプラーを注射器から外し、注射針を取り付けます。針をシリンジのベースにしっかりとねじ込み、漏れを防ぐためにしっかりと固定されていることを確認します。この実験には108μmのI.D.針(針長13mm、ポイントスタイル3)を用いた。結晶サイズとビームサイズに応じて、51 μmまたは108 μmのI.D.ニードルを取り付けます。 注:ビーム時間の前にサンプルストリームの事前テストは、正しいインジェクタの針のサイズを選択することができるようにする必要があります。サンプル特性(すなわち、粘度、充電、緩衝剤組成物)および針I.D.に応じて、サンプルは異なる流れになる。したがって、データ収集中の信号対雑音比を最大化するために、可能な限り最小のI.D.針で最も安定した流れを作り出すために、さまざまな針サイズをテストすることをお勧めします。</li>
	<li>インジェクタが既に取り付けられ、ビームラインに位置合わせされている場合は、セクション3に移動し、サンプルシリンジを直接インジェクタに取り付ける。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
</ol>2. インジェクターの取り付けと制御
<ol><li>インジェクターをビームラインに取り付ける。MX2ビームラインの極低温ノズルを取り外し、インジェクタに交換します。極低温ノズルを保持するクランプねじを緩め、電動ステージの隣にあるブラケットに取り付けます。</li>
	<li>黒いハンドルを持ってトロリーからインジェクタを持ち上げ、電動ステージに置きます。<ol>
<li>電動ステージにインジェクタを締める。黒いクランプスクリューノブを手で締めます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>空の注射器をインジェクターに取り付ける<ol>
<li>インジェクタ コンピュータコントロール インターフェイス (EPOS 位置制御ソフトウェア) で、ソフトウェア メニューの[ツール]の [ホーミング モード] を選択します。次に、[負の限界スイッチ]を選択し、[ホーミングを開始]を選択して、ネジがネジの下に収まるように十分にネジが引き込まれるまでソフトウェアを実行します。教師なし実行する場合、リミットスイッチは自動的にねじを停止します。</li>
		<li>空の(ダミーの)注射器を注射器に取り付け、注射器ホルダーのスリットに針を挿入します。シリンジをブラケットに合わせて並ぶ。</li>
		<li>2つのOリングで注射器を締め付け。<ol>
<li>最初のOリングをシリンジの中間部に巻き付け、シリンジの両側のフックに取り付けます。</li>
			<li>2 番目の O リングをシリンジの上部のフックの周りにループし、デモンストレーションと図 1Bに示すように、O リングの一部をガラスのスポイトの上に置きます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>X線ビームにインジェクタを合わせる<ol>
<li>ビームライン制御ソフトウェアを使用して、インジェクタを使用してX線相互作用点に向かって電動ステージを移動します。インラインカメラを使用して視覚化できます。ビームのサイズと位置は、画面上の赤い十字で示され、電動ステージは、X線相互作用領域に針を整列させるために移動することができます。</li>
		<li>ステージの x と y の位置を調整して、針を赤い十字に合わせます。</li>
		<li>針先が焦点になるまで z 位置を調整します。</li>
		<li>針先とX線ビームの位置合わせを、ギリンジ先端がビームラインカメラで生成された光学顕微鏡画像に見える十字線と合致していることを確認して確認します。</li>
		<li>針先が揃ったら、十字の上に先端を動かします。これにより、針先からX線散乱を除去します。 注:シンクロトロンでMX2ビームライン上のインジェクターの取り付けと位置合わせは、ビームラインの科学者によって行われ、30分以内に完了することができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. サンプルシリンジの取り付け
<ol><li>ステップ 2.3 に従って、空のシリンジをサンプルシリンジに置き換えます。</li>
	<li>サンプルシリンジプランジャーヘッドにインジェクターキャップを置きます。</li>
	<li>ドライブねじをキャップの上部に移動します。</li>
	<li>インジェクタ制御ソフトウェアで [ベロシティ モード] を選択します。</li>
	<li>設定値として3000 rpm(〜115 nL/s)を入力し、設定値を適用を押します。</li>
	<li>ドライブねじがシリンジプランジャヘッドのキャップに触れたら、モーターを止めます。<ol>
<li>ねじがキャップに近づくと 、設定値 を「0」に変更して、インジェクタ制御ソフトウェアでrpm値をゼロに設定します。</li>
		<li>接触が行われたら、設定値を 適用 を押してプリセット値を有効にして、すぐにねじを停止します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>キャップを軽くく振り回して、しっかりと所定の位置に固定されていることを確認します。 メモ:コントロールソフトウェアの [設定値 ]ボックスに新しい設定値が入力されると、 設定値の適用を押した後にのみ有効になります。</li>
</ol>4. インジェクタの実行
<ol><li>キャップドライブのネジがプランジャの上部にしっかりと接触した後、rpm 設定値 を100に変更します。これは~4 nL/sに相当します。</li>
	<li>サンプルが最初に出てきたときに針先を視覚的に検査するか、針のビームラインカメラ画像を見て、サンプルが針先から押し出し始めるときに観察します。</li>
	<li>小屋の捜索を行い、小屋のドアを閉め、X線ビームをオンにします。この時点から、インジェクターは小屋の外から遠隔操作されなければならない。</li>
	<li>安定したストリームが生成されるまで、rpm を調整します。<ol>
<li>rpm 設定値 を90に下げます。</li>
		<li>ステップ 4.4.1 を繰り返し、rpm 設定値 を 10 ずつ減らすと、ストリームは遅くなりますが、安定したストリームを維持します。シリコーングリースの場合は30rpmの値が使用された。 注:典型的なrpmの範囲はサンプルの特徴およびX線の露出時間によって30-100のrpm(1- 4 nL/s)間で変わる。一般に、rpmは安定した流れを維持しながら(サンプル消費を最小にする)最も遅い流量を作り出すために調整されるべきである。</li>
	</ol>
</li>
	<li>フローがうまくないサンプル ストリームを管理する。<ol>
<li>ストリームがまっすぐになるまで、rpm 設定値 を10ずつ増やし続けます。ストリームが安定しない場合は、rpm 設定値 を最大値の100rpmに大きくした後でも、下記の2つの方法のいずれかを実施して安定性を向上させようと試みる。<ol>
<li>最初の方法:サンプルストリームの下にポリスチレンサンプルキャッチャーを挿入して、サンプルを導きます。この方法は、高い料金のサンプル ストリームに適しています。</li>
			<li>2番目の方法:ベンチュリ吸引漏斗をサンプルキャッチャーに挿入します。漏斗に空気を供給するには、小屋にある空気出口管に接続する。この方法は、ストリームの電荷とは無関係にサンプルフローを導き、安定化する際に役立つ。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>一定の安定した流れが得られたら、データ収集を開始し、通常のX線結晶学実験に従って検出器距離を最適化します。 注: rpm は、補足情報「Lipidico デバイス電卓」の提供された変換テーブルを使用して流量に変換されます。この計算機を使用して流量を計算するには、rpm値、針の直径、シリンジのボリュームを入力します。</li>
</ol>

<ol>
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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inert+crystal+delivery+medium+for+serial+femtosecond+crystallography.">A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography.</a> International Union of Crystallography. 2, 421-430 (2015).</li><li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grease+matrix+as+a+versatile+carrier+of+proteins+for+serial+crystallography.">Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography.</a> Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2015).</li><li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil-free+hyaluronic+acid+matrix+for+serial+femtosecond+crystallography.">Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography.</a> Scientific Reports. 6, 24484 (2016).</li><li>Fromme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+femtosecond+crystallography+of+soluble+proteins+in+lipidic+cubic+phase.">Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase.</a> International Union of Crystallography. 2, 545-551 (2015).</li><li>Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Delivery+of+Protein+Microcrystals+in+Lipidic+Cubic+Phase+for+Serial+Femtosecond+Crystallography.">Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54463 (2016).</li><li>Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+microcrystals+in+lipidic+cubic+phase+for+serial+femtosecond+crystallography.">Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).</li><li>Hadian-Jazi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peak-finding+algorithm+based+on+robust+statistical+analysis+in+serial+crystallography.">A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).</li><li>Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Liquid+Handling+for+Life+Science:+A+critical+review+of+the+current+state+of+the+art.">Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).</li></ol>

MKは、Kuselのデザインのために働く。カスタムラボデバイス開発者のKusel Designは、ラ・トローブ大学のピーター・ベントセン博士とANSTOのトム・カラドック・デイヴィス博士と協力し、オーストラリアのシンクロトロンのMX2ビームラインで高粘性研究を可能にする低コストデバイスを開発しました。この装置は、カラドック・デイヴィス博士と綿密に協議して開発されました。著者は競合する財政的利益を持っていません。

シンクロトロン源でSX実験を行うのに理想的な代替HVIが開発されました。既存の HVI に対して 2 つの重要な利点があります。まず、従来の結晶学とSXの間で迅速な切り替えを可能にするビームラインに設置することが容易であり、MX2の設置とアライメントには30分程度必要です。第二に、結晶を成長させるために使用されるサンプルシリンジは、直接注入のための貯蔵所として使用することが?...

シリアル結晶学(SX)は、X線自由電子レーザー(XFELs)1、2、3、4の文脈で最初に開発された技術です。固定ターゲットアプローチはSX5、6、7に使用できますが、通常、インジェクターシステムはX線ビームに連続した流れの結晶を送達するために使用されます。SXは多数の結晶からのデータを組み合わせることから、実験中に結晶のアライメントを必要としないため、室温8,9でデータを収集できます。適切なインジェクターの助けを借りて、結晶はX線相互作用領域に一つずつ流され、得られた回折データは領域検出器9、10上で収集される。現在までに、SXは、従来の結晶学を用いて測定するには小さすぎる結晶を含む多くのタンパク質構造1、11、12、13の解法に成功しています。また、XFELのフェムト秒パルス持続時間を利用することで、時間分解分子動力学に関する新たな洞察を提供しました。光レーザー光源を用いてポンププローブ反応を起こして、光システムII14,15,光活性黄色タンパク質16,17,シトクロムCオキシダーゼ18,ならびにバクテリオロドプシン19,20,21に関する詳細な研究が行われている。これらの研究は、時間分解された生物学的プロセスを理解するための連続結晶学の有意な可能性を示す光活性化後に起こる電子移動ダイナミクスを調査した。
シンクロトロン源9,12,20,23,24では逐次結晶学の開発も普及しつつある。シンクロトロンベースのSXにより、適切なインジェクターシステムを使用して、多数の個々の結晶を室温で効率的に測定することができます。このアプローチは、それゆえ、より小さい結晶に適しており、データを収集するために高速なフレームレート検出器を必要とすることに加えて、マイクロ焦点を当てたビームも必要とされる。従来の結晶学と比較して、SXはX線ビーム中の個々の結晶の取り付けおよび位置合わせを伴わない。多数の個々の結晶からのデータがマージされるため、各結晶によって受け取られる放射線量は、従来の結晶学に比べて大幅に低減することができる。シンクロトロンSXはまた、ミリ秒のレジームまで、十分に高いフレームレートを有する検出器を提供する時間分解反応の研究に適用することができる(例えば、100Hz以上)。XFELソース20,22,23で最初に開発されたインジェクターを用いてシンクロトロンでいくつかの連続結晶学実験が行われている。インジェクタの 2 つの最も一般的なタイプは、ガスダイナミックバーチャルノズル (GDVN)25と高粘性インジェクター (HVI)9、24 、26、27、28です。GDVNは低粘度、液体サンプルを注入するのに理想的であるが、安定した流れを達成するために高い流量を必要とし、その結果、高いサンプル消費率を導く。対照的に、HVIは、はるかに低い流量で安定した流れを生成することを可能にする高粘度サンプルに適しており、サンプル消費量がはるかに低くなります。したがって、HVIインジェクタは、粘性キャリアが好ましい(例えば、膜タンパク質の脂質ベース)および/または大量のサンプルが利用できないサンプルの送達を好む。SXインジェクターは一般的に使用が困難であり、操作するために広範なトレーニングが必要です。また、サンプルを特殊な貯蔵所にロードする必要があるため、サンプル転送プロトコルは長く、これは一般的に「死んだボリューム」または接続の漏出によって失われるサンプルのリスクが高くなります。したがって、X線ビームに到達する前に、あらゆる損失を軽減するためにインジェクタ設計を最適化することが望ましい。
最近、最初のSX結果は、アイガー16M検出器を用いてリソザイム標的を有するリピディコ23を用いて発表された。このインジェクター設計は、初期結晶化からインジェクターへの結晶の伝達に移り、その後にサンプルをX線ビームに送達するステップの数を最小限に抑えることによって、サンプルの浪費を制限します。この原稿は、サンプル調製から始まり、注入プロセスに移り、そして最後に同じ結晶化容器を用いてデータ収集するサンプル移送手順を説明し、デモンストレーションする。インジェクタの動作についても説明する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hen eggwhite lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum silicon grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td>Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector needle (108 &#181;m ID)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>part No: 7803-05</td>
			<td>www.hamiltoncompany.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass gas-tight syringes, 100 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>part no: 7656-01</td>
			<td>Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCP syringe coupler</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>209526</td>
			<td>Syringe coupler to mix the samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidico injector</td>
			<td>La Trobe Univerity/ANSTO</td>
			<td></td>
			<td>This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipidico injection protocol for serial crystallography measurements at the australian synchrotron

オーストラリアのシンクロトロンで、連続結晶学測定を行う施設が開発されました。高粘性インジェクターであるリピコを組み込み、高分子結晶学(MX2)ビームラインの一部として、室温で多数の小結晶を測定します。この技術の目的は、結晶を成長/ガラス注射器に移し、連続結晶学データ収集用のインジェクターで直接使用できるようにすることです。このインジェクタの利点は、流れの中断なしに流量の変化に迅速に応答する能力を含む。この高粘度インジェクター (HVI) には、許容されるサンプル粘度の制限を含むいくつかの制限があります。ストリームの安定性は、サンプルの特定のプロパティによっては問題になる可能性もあります。オーストラリアのシンクロトロンでの連続結晶学測定用のサンプルの設定方法とインジェクターの操作方法の詳細なプロトコルを紹介します。この方法は、高粘性媒体へのリソチーム結晶の転写(シリコーングリース)、MX2でのデータ収集用インジェクターの動作を含むサンプルの調製を実証する。

Lipidico は、MX2 で使用する代替配信システムとして構築された HVI です (図 1)。これは、結晶が脂質立方相で成長するか、または高粘性不活性培地に移されるSXに最適です。
インジェクター用途を実証するために、リソチーム結晶と混合したシリコーングリースを使用して、オーストラリアのシンクロトロンのMX2ビームラインでSXデータを収集した。?...

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Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

このプロトコルの目的は、最近オーストラリアのシンクロトロンで委託された高粘性インジェクター、Lipidicoでデータ収集のための連続結晶学サンプルを準備する方法を実証することです。

オーストラリアシンクロトロンにおける逐次結晶学測定用リピニコ注入プロトコル

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

lipidico-injection-protocol-for-serial-crystallography-measurements

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3.2K ビュー.  La Trobe University, Melbourne, Australia, 3086. このプロトコルの目的は、最近オーストラリアのシンクロトロンで委託された高粘性インジェクター、Lipidicoでデータ収集のための連続結晶学サンプルを準備する方法を実証することです。

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Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

蛍光顕微鏡を用いたイメージング細胞遊走用接着剤及び可溶性グラデーションを作成する

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

生物工学

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Tomoautoの使用：ハイスループット自動クライオ電子断層撮影のためのプロトコル

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

水質浄化のための膜のような防汚特性を持つハイドロゲルの合成

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. However, the experimental determination of the power input in small-scale vessels is still challenging due to relatively high friction losses inside typically used bushings, bearings and/or shaft seals and the accuracy of commercially available torque meters. Thus, only limited data for small-scale bioreactors, in particular single-use systems, is available in the literature, making comparisons among different single-use systems and their conventional counterparts difficult.
This manuscript provides a protocol on how to measure power inputs in benchtop scale bioreactors over a wide range of turbulence conditions, which can be described by the dimensionless Reynolds number (Re). The aforementioned friction losses are effectively reduced by the use of an air bearing. The procedure on how to set up, conduct and evaluate a torque-based power input measurement, with special focus on cell culture typical agitation conditions with low to moderate turbulence (100 &#60; Re &#60; 2&#183;104), is described in detail. The power input of several multi-use and single-use bioreactors is provided by the dimensionless power number (also called Newton number, P0), which is determined to be in the range of P0 &#8776; 0.3 and P0 &#8776; 4.5 for the maximum Reynolds numbers in the different bioreactors.

The power input in stirred bioreactors can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. This manuscript describes how an air bearing can be used to effectively reduce friction losses observed in mechanical seals and improve the accuracy of power input measurements in small-scale vessels.

実験室規模で撹拌したバイオリアクターでのパワー入力測定

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally delivering bioactive compounds to the salivary glands, greater tissue concentrations can be safely achieved versus systemic administration. Furthermore, off target tissue effects from extra-glandular accumulation of material can be dramatically reduced. In this regard, retroductal injection is a widely used method for investigating both salivary gland biology and pathophysiology. Retroductal administration of growth factors, primary cells, adenoviral vectors, and small molecule drugs has been shown to support gland function in the setting of injury. We have previously shown the efficacy of a retroductally injected nanoparticle-siRNA strategy to maintain gland function following irradiation. Here, a highly effective and reproducible method to administer nanomaterials to the murine submandibular gland through Wharton's duct is detailed (Figure 1). We describe accessing the oral cavity and outline the steps necessary to cannulate Wharton's duct, with further observations serving as quality checks throughout the procedure.

Local drug delivery to the submandibular glands is of interest in understanding salivary gland biology and for the development of novel therapeutics. We present an updated and detailed retroductal injection protocol, designed to improve delivery accuracy and experimental reproducibility. The application presented herein is the delivery of polymeric nanoparticles.

マウス顎下腺への Retroductal ナノ粒子注入

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and product concentration are essential components for most manufacturing processes. However, at the early stages of product development, these steps are often performed manually. Manual dead-end centrifugation for buffer exchange is labor-intensive, costly, and not scalable. A closed automated system can effectively eliminate this laborious step, but implementation can be challenging. Here, we describe a newly developed cell processing device that is suitable for small- to medium-scale cell processing and aims to bridge the gap between manual processing and large-scale automation. This protocol can be easily applied to various cell types and processes by modifying the flow rate and centrifugation speed. Our protocol demonstrated high cell recovery with shorter processing times in comparison to the manual process. Cells recovered from the automated process also maintained their proliferation rates. The device can be applied as a modular component in a closed manufacturing process to accommodate steps such as buffer exchange, cell formulation, and cryopreservation.

Automation is key to upscaling and cost management in cell manufacturing. This manuscript describes the use of a counterflow centrifugal cell processing device for automating the buffer exchange and cell concentration steps for small-scale bioprocessing.

小規模セル処理のための自動カウンターフロー遠心システム

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and ...

Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized matrix. This organization is challenging to replicate due to the heterogeneous environment of bone. Ceramic omnidirectional bioprinting in cell-suspensions (COBICS) is a microgel-based bioprinting technique that uniquely replicates the mineral and cellular structure of bone. COBICS prints complex, biologically relevant constructs without the need for sacrificial support materials or harsh postprocessing steps (e.g., radiation and high-temperature sintering), which are two of the biggest challenges in the additive manufacturing of bone mimetic constructs. This technique is enabled via the freeform extrusion of a novel calcium phosphate-based ink within a gelatin-based microgel suspension. The yield-stress properties of the suspension allow deposition and support the printed bone structure. UV crosslinking and nanoprecipitation then "lock" it in place. The ability to print nanostructured bone-mimetic ceramics within cell-laden biomaterials provides spatiotemporal control over macro- and micro-architecture and facilitates the real-time fabrication of complex bone constructs in clinical settings.

This protocol describes a 3D printing technique to fabricate bone-like structures by depositing a calcium phosphate ink in a gelatin-based granular support. Printed bone analogs are deposited in freeform, with flexibility for direct harvesting of the print or crosslinking within a living cell matrix for multiphasic constructs.

骨類似体の生成のための細胞内懸濁液中のセラミック全方向性バイオプリンティング

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a chemotherapeutic might be functionalized with an antibody to enhance binding to cancer cells (&#34;targeting&#34;) or functionalized with polyethylene glycol to help evade immune cell recognition (&#34;stealth&#34;). Even at a cellular level, optimizing the binding and uptake of a drug carrier is a complex biological design problem. Thus, it is valuable to separate how strongly a new carrier interacts with a cell from the functional efficacy of a carrier&#39;s cargo once delivered to that cell.
To continue the chemotherapeutic example, &#34;how well it binds to a cancer cell&#34; is a separate problem from &#34;how well it kills a cancer cell&#34;. Quantitative in vitro assays for the latter are well established and usually rely on measuring viability. However, most published research on cell-carrier interactions is qualitative or semiquantitative. Generally, these measurements rely on fluorescent labeling of the carrier and, consequently, report interactions with cells in relative or arbitrary units. However, this work can be standardized and be made absolutely quantitative with a small number of characterization experiments. Such absolute quantification is valuable, as it facilitates rational, inter- and intra-class comparisons of various drug delivery systems-nanoparticles, microparticles, viruses, antibody-drug conjugates, engineered therapeutic cells, or extracellular vesicles.
Furthermore, quantification is a prerequisite for subsequent meta-analyses or in silico modeling approaches. In this article, video guides, as well as a decision tree for how to achieve in vitro quantification for carrier drug delivery systems, are presented, which take into account differences in carrier size and labeling modality. Additionally, further considerations for the quantitative assessment of advanced drug delivery systems are discussed. This is intended to serve as a valuable resource to improve rational evaluation and design for the next generation of medicine.

Experimental Quantification of Interactions Between Drug Delivery Systems and Cells In Vitro: A Guide for Preclinical Nanomedicine Evaluation

A workflow is demonstrated for the absolute quantification of drug carrier-cell interactions using flow cytometry to allow better rational evaluation of novel drug delivery systems. This workflow is applicable to drug carriers of any type.

in vitroでのドラッグデリバリーシステムと細胞間の相互作用の実験的定量:前臨床ナノメディシン評価のためのガイド

A major component of designing drug delivery systems concerns how to amplify or attenuate interactions with specific cell types. For instance, a ...

組織損傷を軽減するための新しい低侵襲スローインジェクション法

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient amount of suspension solution to allow the cells to enter the tissue. The volume of the suspension solution affects the tissue, and this can cause major invasive injury as a result of the cell injection. This paper reports on a novel cell injection method, called slow injection, that aims to avoid this injury. However, pushing out the cells from the needle tip requires a sufficiently high injection speed according to Newton's law of shear force. To solve the above contradiction, a non-Newtonian fluid, such as gelatin solution, was used as the cell suspension solution in this work. Gelatins solution have temperature sensitivity, as their form changes from gel to sol at approximately 20 &#176;C. Therefore, to maintain the cell suspension solution in the gel form, the syringe was kept cooled in this protocol; however, once the solution was injected into the body, the body temperature converted it to a sol. The interstitial tissue fluid flow can absorb excess solution. In this work, the slow injection technique allowed cardiomyocyte balls to enter the host myocardium and engraft without surrounding fibrosis. This study employed a slow injection method to inject purified and ball-formed neonatal rat cardiomyocytes into a remote area of myocardial infarction in the adult rat heart. At 2 months following the injection, the hearts of the transplanted groups showed significantly improved contractile function. Furthermore, histological analyses of the slow-injected hearts revealed seamless connections between the host and graft cardiomyocytes via intercalated disks containing gap junction connections. This method could contribute to next-generation cell therapies, particularly in cardiac regenerative medicine.

著者スポットライト:最小限の侵襲で新しい細胞注入法  

This method eliminates any major invasion during cell injections caused by the cell suspension solution.

浸潤の少ない新規細胞注入法

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient ...