O objetivo deste filme é demonstrar o procedimento de nossa nova abordagem para pacientes com disfunção ovariana. A função ovariana diminui progressivamente durante o envelhecimento e algumas condições fisiofisiológicas, incluindo anormalidade do karyótipo, doenças autoimunes, terapias de quimioterapia e radiação e cirurgias ovarianas. A maioria das mulheres de meia-idade com baixa reserva ovariana mostrou baixa resposta ovariana à estimulação ovariana por produzir oócitos maduros.
Além disso, pacientes jovens com baixo número de folículos antral também apresentaram baixa resposta ovariana à estimulação ovariana. A preservação da fertilidade é importante para salvar o potencial OCS para futura gravidez. Para preservação da fertilidade, foi estabelecida criopreservação oócida.
No entanto, esses pacientes de resposta ovariana pobres poderiam recuperar um número muito limitado de oócitos mesmo após a estimulação ovariana adequada, levando à exigência de procedimentos caros repetidos para garantir um número suficiente de oócitos para garantir um bebê. Para resolver essas questões, desenvolvemos recentemente a ativação in vitro, procedimento IVA, que nos permite estimular o estágio inicial dos folículos ovarianos a se desenvolverem até o estágio folículo pré-antral. O procedimento original de IVA pode promover o crescimento primordial, primário e secundário do folículo por fragmentação do córtex ovariano, levando à interrupção da sinalização do hipopótamo.
Isso é então seguido por dois dias de cultivo com estimulador de sinalização Akt. Este procedimento é adequado para pacientes poi com poucos folículos residuais. No entanto, este procedimento é um tratamento excessivo para os pacientes que possuem múltiplos folículos secundários.
Para os pacientes que possuem alguns folículos secundários residuais, estabelecemos o método chamado IVA livre de drogas e já testamos a possibilidade de promover o crescimento secundário do folículo, interrompendo apenas a via de sinalização do hipopótamo. Também tivemos alguns casos bem sucedidos de entrega por IVA sem drogas. Já publicamos o procedimento cirúrgico da IVA livre de drogas e o protocolo de seguir a estimulação ovariana.
Neste vídeo, apresentamos os detalhes dos métodos laboratoriais necessários para o IVA livre de drogas. Recrutamos os pacientes para IVA sem drogas com base nos critérios de Bolonha. Os pacientes podem ter múltiplos folículos secundários.
No início, parte do córtex foi removida de um ou ambos os ovários por laparoscopia. Os pacientes por são aqueles que tinham ovários de médio porte. Na maioria dos pacientes, extraímos apenas parte dos tecidos cortical dos ovários em um ou ambos os lados.
Tecidos críticos extraídos foram imediatamente transferidos para um prato de cultura contendo meio de cultura com tampão HEPES, e dissecado este pequeno tecido em pequenos cubos para interrupção da sinalização de hipopótamo. Detalhes do procedimento serão mostrados neste vídeo. A via de sinalização do hipopótamo é essencial para manter o tamanho ideal do órgão.
Esse caminho consiste em vários reguladores de crescimento negativos. Uma vez que a sinalização do hipopótamo é interrompida, os níveis de fosforilação do YAP, um dos reguladores de crescimento negativo que atuam em uma cascata de quinase, é diminuído e os níveis nucleares de YAP são aumentados. A YAP atua em conjunto com fatores transcricionais TEAD para aumentar o fator de crescimento da CCN a jusante.
Por outro lado, a polimerização atuarina da atuação globular, G-actin, à forma filamentosa, F-actin, é importante para a manutenção e locomoção da forma celular. A indução relatada anteriormente da formação de F-actin interrompe a sinalização do hipopótamo e induz o crescimento excessivo em células hela humanas. Anteriormente, relatamos que a fragmentação ovariana aumenta a formação de F-actin, e isso leva à diminuição do nível de fosforilação do YAP.
Leva ao aumento da expressão do fator de crescimento da CCN. Após o corte, esses cubos são enxertados no ovário restante. Este procedimento pode promover o crescimento residual secundário do folículo e levar a um aumento do número de oócitos maduros.
IVA livre de drogas consiste em quatro passos. Já publicamos o procedimento cirúrgico para IVA livre de drogas. Por favor, consulte essa literatura para extração do córtex ovariano e enxerto automático.
Aqui mostramos os procedimentos detalhados dos métodos laboratoriais necessários para o IVA livre de drogas. No primeiro passo, mostramos como a fragmentação do córtex ovariano é realizada. Na segunda etapa, mostramos como carregar os cubos corticais ovarianos no dispositivo para transplante, aqui, vou mostrar a fragmentação do córtex ovariano.
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do nosso instituto, e todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Código de Ética da Associação Médica Mundial. Fragmentação do córtex ovariano. As seguintes ferramentas necessárias para esta etapa: um prato, gaze estéril, tesoura fina, fórceps finos e bisturi.
Geralmente usamos esse tipo de prato e gaze estéril, mas outros produtos como placa de petri de plástico, placa de vidro, etc, também podem ser adequados para este procedimento, e qualquer tipo de gaze estéril também é adequado. No entanto, recomendamos fortemente o uso desta forma de fórceps e bisturi. Além disso, use a placa quente para manter a temperatura dos pratos contendo tecidos Coloque sob a cortina estéril.
Os tecidos cortical são imediatamente transferidos para o prato contendo mHTF. Tire uma foto com o nome do paciente por se correlacionar com os dados do paciente. Regisso tamanho, espessura e condição do tecido.
Remova tecido de medula residual. Antes da fragmentação do tecido, remova o tecido medular. Coloque o córtex na gaze estéril.
Como mostrado no vídeo, a gaze é umedeçada com meio. Durante este procedimento, aplique o meio com uma pipeta descartável antes que a superfície do córtex seja seca. Remova tecidos residuais com micro tesouras até que a espessura atinja de um a dois milímetros.
Em pacientes com POR, os folículos secundários estão localizados mais fundo do que um milímetro da superfície do córtex, por isso não fazem com que os tecidos fiquem a menos de um milímetro de espessura. Corte um lado do córtex de cada tecido em uma tira medindo um por um por cinco milímetros para análise histológica para determinar a presença de folículos residuais. Coloque esta tira em tubo de 1,5 mililitro com meio de cultura e mantenha a quatro graus Celsius até a fixação.
Preparação de cubos cortical ovarianos. Após a remoção do tecido medular, o cortical ovariano é fragmentado para interrupção da sinalização do hipopótamo. No início, corte o córtex em tiras de um por 10 milímetros usando bisturi.
Em seguida, corte essas tiras em um milímetro cubos pequenos. No meio, o tecido é escorregadio e difícil de cortar. Para um corte fácil, corte as tiras pressionando o bisturi em vez de puxando-o.
Após o corte, conte o número de cubos e prepare o enxerto automático. Para evitar as alterações da pressão osmótica no meio, adicione o meio com moderação antes do enxerto automático do tecido. Para enxerto automático ovariano, o uso de um dispositivo em forma de cânula permite um carregamento mais fácil.
Esta etapa contém dois passos. Anteriormente, fragmentos ovarianos eram transplantados um a um usando fórceps sob laparoscopia. No entanto, levou cerca de três a quatro horas para a cirurgia ser concluída.
Neste procedimento, usamos um dispositivo em forma de cannular feito de uma seringa interna e um cilindro externo. Esta é uma forma simples e leve. Além disso, a ponta deste dispositivo é de uma forma redonda.
Não há pontos afiados que evitem danos ao local do transplante. O uso deste tipo de dispositivo permite levar de 20 a 30 cubos para o local de implantação ao mesmo tempo. Isso leva a um transplante eficiente e à redução do tempo de cirurgia.
Carregando fragmentos cortical ovarianos. Preparação da cânula IVA. Prepare a cânula IVA e lave este dispositivo em mHTF.
Repita aspirar e descarregar o meio várias vezes. Encha a ponta de um cannular aspirando cerca de 100 microliters do meio. Isto é para evitar que os cubos se retirem durante o carregamento do fragmento de tecido.
Carregando cubos corticais. Escolha um cubo por fórceps finos e coloque-o na ponta do cannular. O número de cubos auto-enxertados depende do tamanho do local do transplante.
Repita carregar os cubos um a um até atingir o número de destino. Depois de carregar os cubos, passe a cânula para o cirurgião cuidadosamente. Se o local de enxerto não estiver pronto, a parte do cannular que contém cubos ovarianos deve ser mantida pelos dedos para evitar uma diminuição na temperatura dos cubos.
Já reportamos os resultados clínicos da IVA livre de drogas. Consulte o artigo publicado sobre resultados clínicos. Este protocolo de laboratório exigiu de 30 a 50 minutos para um paciente.
O tempo médio é de 10 a 20 minutos para fragmentação do córtex ovariano, e de 20 a 30 minutos para carregar esses fragmentos na cânula IVA. Isso depende do tamanho do tecido, mas quase todos os pacientes podem ser concluídos neste tempo médio. Conclusões. IVA sem drogas é uma nova abordagem do tratamento da infertilidade para pacientes com POR com diminuição da reserva ovariana.
Estes protocolos laboratoriais levam à redução do tempo necessário para a cirurgia e à perda de fragmentos durante o transplante. A técnica laboratorial de IVA livre de drogas pode se tornar a base da aplicação futura da cultura do tecido ovariano para obter oócitos maduros sem enxerto.
