Le but de ce film est de démontrer la procédure de notre nouvelle approche aux patientes présentant un dysfonctionnement ovarien. La fonction ovarienne diminue progressivement pendant le vieillissement et quelques conditions pathophysiologiques comprenant l’anomalie de karyotype, les maladies autoimmunisées, les thérapies de chemo et de radiation, et les chirurgies ovariennes. La plupart des femmes entre deux âges avec une réserve ovarienne basse ont montré la réponse ovarienne pauvre à la stimulation ovarienne pour rapporter des ovocytes mûrs.
En outre, de jeunes patients présentant un nombre bas de follicules antral ont également montré la réponse ovarienne pauvre à la stimulation ovarienne. La préservation de la fertilité est importante pour sauver l’OCS potentiel pour la grossesse future. Pour la conservation de la fertilité, la cryoconservation des ovocytes a été établie.
Cependant, ces patientes souffrant d’une mauvaise réponse ovarienne pourraient récupérer un nombre très limité d’ovocytes même après une stimulation ovarienne appropriée, ce qui a conduit à l’exigence de procédures coûteuses répétées pour assurer un nombre suffisant d’ovocytes pour garantir un bébé. Pour résoudre ces problèmes, nous avons récemment développé l’activation in vitro, la procédure IVA, qui nous permet de stimuler le stade précoce des follicules ovariens à se développer au stade follicule pré-antral. Le procédé original d’IVA peut favoriser la croissance primordiale, primaire, et secondaire de follicule par fragmentation ovarienne de cortex, menant à la perturbation de signalisation d’hippopotame.
Ceci est ensuite suivi de deux jours de culture avec le stimulateur de signalisation Akt. Ce procédé convient aux patients de POI présentant peu de follicules résiduels. Cependant, cette procédure est un traitement excessif pour les patients qui ont les follicules secondaires multiples.
Pour les patients qui ont quelques follicules secondaires résiduels, nous avons établi la méthode appelée IVA sans médicament et avons déjà testé la possibilité de favoriser la croissance secondaire de follicule en perturbant seulement la voie de signalisation d’hippopotame. Nous avons également eu quelques cas réussis d’accouchement par IVA sans drogue. Nous avons déjà publié la procédure chirurgicale de l’IVA sans médicament et le protocole de stimulation ovarienne suivante.
Dans cette vidéo, nous présentons les détails des méthodes de laboratoire requises pour les IVA sans médicament. Nous avons recruté les patients pour l’IVA sans médicament sur la base des critères de Bologne. Les patients pourraient avoir les follicules secondaires multiples.
Au début, une partie du cortex a été enlevée d’un ou des deux ovaires par laparoscopie. Les patients atteints de POR sont ceux qui avaient des ovaires de taille moyenne. Dans la plupart des patients, nous avons extrait seulement une partie des tissus corticaux des ovaires d’un ou des deux côtés.
Les tissus critiques extraits ont été immédiatement transférés à une parabole contenant un milieu de culture avec un tampon HEPES, et ont disséqué ce petit tissu en petits cubes pour la perturbation de signalisation de l’hippopotame. Les détails de la procédure seront montrés dans cette vidéo. La voie de signalisation hippopotame est essentielle pour maintenir une taille d’organe optimale.
Cette voie se compose de plusieurs régulateurs de croissance négatifs. Une fois que la signalisation de l’hippopotame est perturbée, les niveaux de phosphorylation de YAP, l’un des régulateurs de croissance négatifs agissant dans une cascade de kinases, sont diminués et les niveaux nucléaires de YAP sont augmentés. YAP agit de concert avec les facteurs transcriptionnels TEAD pour augmenter le facteur de croissance CCN en aval.
D’autre part, la polymérisation de l’actine globulaire, la G-actine, à la forme filamenteuse, la F-actine, est importante pour le maintien de la forme cellulaire et la locomotion. L’induction précédemment rapportée de la formation de F-actine perturbe la signalisation d’hippopotame et induit la surcroissance en cellules humaines de HeLa. Nous avons précédemment rapporté la formation ovarienne de F-actine d’augmentation de fragmentation, et elle mène à la diminution du niveau de la phosphorylation de YAP.
Il conduit à une expression accrue du facteur de croissance CCN. Après la coupe, ces cubes sont greffés dans l’ovaire restant. Cette procédure peut favoriser la croissance secondaire résiduelle de follicule et conduire à un plus grand nombre d’ovocytes mûris.
L’IVA sans drogue se compose de quatre étapes. Nous avons déjà publié la procédure chirurgicale pour IVA sans médicament. Veuillez vous référer à cette littérature pour l’extraction du cortex ovarien et l’auto-greffe.
Ici, nous montrons les procédures détaillées des méthodes de laboratoire requises pour IVA sans médicament. Dans la première étape, nous montrons comment la fragmentation du cortex ovarien est effectuée. Dans la deuxième étape, nous montrons comment charger les cubes corticaux ovariens dans le dispositif de transplantation, Ici, Je vais montrer la fragmentation du cortex ovarien.
Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique de notre institut, et toutes les procédures ont été effectuées conformément au Code d’éthique de l’Association médicale mondiale. Fragmentation du cortex ovarien. Les outils suivants sont requis pour cette étape: un plat, de la gaze stérile, des ciseaux fins, une pince fine et un scalpel.
Nous utilisons généralement ce type de plat et de gaze stérile, mais d’autres produits comme la boîte de Petri en plastique, la boîte en verre, etc., peuvent également convenir à cette procédure, et tout type de gaze stérile convient également. Nous recommandons cependant fortement l’utilisation de cette forme de forceps et de scalpel. De plus, utilisez la plaque chauffante pour maintenir la température des plats contenant des tissus Placez sous le drapé stérile.
Les tissus corticaux sont immédiatement transférés dans la parabole contenant du mHTF. Prenez une photo avec le nom du patient pour la corrélation avec les données du patient. Notez la taille, l’épaisseur et l’état du tissu.
Enlever le tissu médullaire résiduel. Avant la fragmentation du tissu, enlever le tissu médullaire. Mettez le cortex sur la gaze stérile.
Comme le montre la vidéo, la gaze est humidifiée avec du milieu. Au cours de cette procédure, appliquez le milieu avec une pipette jetable avant que la surface du cortex ne soit desséchée. Enlevez les tissus résiduels avec des micro-ciseaux jusqu’à ce que l’épaisseur atteigne un à deux millimètres.
Chez les patients atteints de POR, les follicules secondaires sont situés à plus d’un millimètre de la surface du cortex, alors ne faites pas les tissus moins d’un millimètre d’épaisseur. Couper un côté du cortex de chaque tissu en une bande mesurant un par un par cinq millimètres pour une analyse histologique afin de déterminer la présence de follicules résiduels. Mettez cette bande dans un tube de 1,5 millilitre avec un milieu de culture et maintenez-la à quatre degrés Celsius jusqu’à la fixation.
Préparation de cubes corticaux ovariens. Après le retrait du tissu médullaire, le cortical ovarien est fragmenté pour la perturbation de signalisation d’hippopotame. Au début, coupez le cortex en bandes de 10 millimètres une par une à l’aide de scalpel.
Ensuite, coupez ces bandes en petits cubes d’un millimètre. Dans le milieu, le tissu est glissant et difficile à couper. Pour une coupe facile, coupez les bandes en appuyant sur le scalpel plutôt qu’en tirant dessus.
Après la coupe, comptez le nombre de cubes et préparez l’auto-greffage. Pour éviter les changements de pression osmotique dans le milieu, ajouter le milieu avec modération avant l’auto-greffe tissulaire. Pour l’auto-greffe ovarienne, l’utilisation d’un dispositif en forme de canule permet un chargement plus facile.
Cette étape contient deux étapes. Précédemment, des fragments ovariens ont été transplantés un par un utilisant le forceps sous la laparoscopie. Cependant, il a fallu environ trois à quatre heures pour que la chirurgie soit terminée.
Dans cette procédure, nous utilisons un dispositif de forme cannulaire composé d’une seringue interne et d’un cylindre extérieur. Il s’agit d’une forme simple et légère. De plus, la pointe de cet appareil est de forme ronde.
Il n’y a pas de points tranchants qui évitent d’endommager le site de transplantation. L’utilisation de ce type d’appareil permet d’amener jusqu’à 20 à 30 cubes sur le site d’implantation en même temps. Cela conduit à une transplantation efficace et à une réduction du temps de chirurgie.
Chargement de fragments corticaux ovariens. Préparation de la canule IVA. Préparez la canule IVA et lavez cet appareil en mHTF.
Répéter aspirer et décharger le milieu plusieurs fois. Remplissez la pointe d’un canulaire en aspirant environ 100 microlitres du milieu. C’est pour éviter que les cubes ne s’étirent pendant le chargement des fragments de tissu.
Chargement de cubes corticaux. Choisissez un cube par pince fine et mettez-le dans la pointe du cannulaire. Le nombre de cubes auto-greffés dépend de la taille du site de transplantation.
Répétez le chargement des cubes un par un jusqu’à ce que vous atteigniez le nombre cible. Après avoir chargé les cubes, passez soigneusement la canule au chirurgien. Si le site de greffe n’est pas prêt, la partie du cannulaire qui contient des cubes ovariens doit être maintenue par les doigts pour éviter une diminution de la température des cubes.
Nous avons déjà rapporté les résultats cliniques de l’IVA sans drogue. Veuillez vous référer à l’article publié sur les résultats cliniques. Ce protocole de laboratoire a exigé 30 à 50 minutes pour un patient.
Le temps moyen est de 10 à 20 minutes pour la fragmentation du cortex ovarien, et de 20 à 30 minutes pour charger ces fragments dans la canule IVA. Cela dépend de la taille du tissu, mais presque tous les patients peuvent être terminés dans ce temps moyen. Conclusions. L’IVA sans drogue est une nouvelle approche de traitement de l’infertilité pour les patientes de POR présentant une diminution de la réserve ovarienne.
Ces protocoles de laboratoire conduisent à la réduction du temps nécessaire à la chirurgie et à la perte de fragments pendant la transplantation. La technique de laboratoire de l’IVA drogue-libre pourrait devenir la base de l’application future de la culture ovarienne de tissu pour obtenir les ovocytes mûrs sans greffe.
