L'obiettivo di questo film è dimostrare la procedura del nostro nuovo approccio ai pazienti con disfunzione ovarica. La funzione ovarica diminuisce progressivamente durante l'invecchiamento e alcune condizioni fisiopatologiche tra cui anomalie del cariotipo, malattie autoimmuni, terapie chemio e radiazioni e interventi chirurgici ovarici. La maggior parte delle donne di mezza età con una bassa riserva ovarica ha mostrato una scarsa risposta ovarica alla stimolazione ovarica per la produzione di ovociti maturi.
Inoltre, i giovani pazienti con un basso numero di follicoli astrali hanno anche mostrato una scarsa risposta ovarica alla stimolazione ovarica. La conservazione della fertilità è importante per salvare il potenziale ARO per la gravidanza futura. Per la conservazione della fertilità, è stata stabilita la crioconservazione degli ovocite.
Tuttavia, questi poveri pazienti con risposta ovarica potrebbero recuperare un numero molto limitato di ovociti anche dopo una corretta stimolazione ovarica, portando alla necessità di ripetute procedure costose per garantire un numero sufficiente di ovociti per garantire un bambino. Per risolvere questi problemi, abbiamo recentemente sviluppato l'attivazione in vitro, la procedura IVA, che ci consente di stimolare la fase iniziale dei follicoli ovariani a svilupparsi allo stadio follicolo pre-antrale. La procedura IVA originale può promuovere la crescita primordiale, primaria e secondaria del follicolo mediante frammentazione della corteccia ovarica, portando a interruzioni della segnalazione dell'ippopotamo.
Questo è poi seguito da due giorni di ristrutturazione con lo stimolatore di segnalazione Akt. Questa procedura è adatta per pazienti con POI con pochi follicoli residui. Tuttavia, questa procedura è un trattamento eccessivo per i pazienti che hanno più follicoli secondari.
Per i pazienti che hanno alcuni follicoli secondari residui, abbiamo stabilito il metodo chiamato IVA senza farmaci e abbiamo già testato la possibilità di promuovere la crescita del follicolo secondario interrompendo solo la via di segnalazione dell'ippopotamo. Abbiamo anche avuto alcuni casi di successo di consegna da parte di IVA senza farmaci. Abbiamo già pubblicato la procedura chirurgica dell'IVA gratuita del farmaco e il protocollo di seguire la stimolazione ovarica.
In questo video, presentiamo i dettagli dei metodi di laboratorio richiesti per l'IVA senza farmaci. Abbiamo reclutato i pazienti per l'IVA senza farmaci sulla base dei criteri di Bologna. I pazienti potrebbero avere più follicoli secondari.
All'inizio, parte della corteccia è stata rimossa da una o entrambe le ovaie per laparoscopia. I pazienti con POR sono quelli che avevano ovaie di medie dimensioni. Nella maggior parte dei pazienti, abbiamo estratto solo una parte dei tessuti corticali dalle ovaie su uno o entrambi i lati.
I tessuti critici estratti sono stati immediatamente trasferiti in un piatto di coltura contenente terreno di coltura con tampone HEPES e sezionato questo piccolo tessuto in piccoli cubi per l'interruzione della segnalazione dell'ippopotamo. I dettagli della procedura saranno mostrati in questo video. La via di segnalazione dell'ippopotamo è essenziale per mantenere le dimensioni ottimali degli organi.
Questo percorso è costituito da diversi regolatori di crescita negativi. Una volta interrotta la segnalazione dell'ippopotamo, i livelli di fosforilazione di YAP, uno dei regolatori di crescita negativi che agiscono in una cascata chinasi, vengono diminuiti e i livelli nucleari di YAP aumentano. YAP agisce di concerto con i fattori trascrizionale TEAD per aumentare il fattore di crescita CCN a valle.
D'altra parte, la polimerizzazione actina dell'azione globulare, G-actina, alla forma filamentosa, F-actina, è importante per il mantenimento e la locomozione della forma cellulare. L'induzione precedentemente riportata della formazione di F-actina interrompe la segnalazione dell'ippopotamo e induce una crescita troppo nelle cellule HeLa umane. In precedenza abbiamo riportato che la frammentazione ovarica aumenta la formazione di F-actina e porta alla diminuzione del livello di fosforilazione dello YAP.
Porta ad una maggiore espressione del fattore di crescita CCN. Dopo il taglio, questi cubi vengono innestati nell'ovaio rimanente. Questa procedura può promuovere la crescita residua del follicolo secondario e portare a un aumento del numero di ovocite maturi.
L'IVA senza droga consiste in quattro passaggi. Abbiamo già pubblicato la procedura chirurgica per l'IVA senza farmaci. Si prega di fare riferimento a quella letteratura per l'estrazione della corteccia ovarica e l'auto-innesto.
Qui mostriamo le procedure di dettaglio dei metodi di laboratorio richiesti per l'IVA senza farmaci. Nel primo passo, mostriamo come viene eseguita la frammentazione della corteccia ovarica. Nel secondo passo, mostriamo come caricare i cubi corticali ovarico nel dispositivo per il trapianto, Qui mostrerò la frammentazione della corteccia ovarica.
Questo studio è stato approvato dal comitato etico del nostro istituto e tutte le procedure sono state eseguite in conformità con il Codice Etico della World Medical Association. Frammentazione della corteccia ovarica. I seguenti strumenti necessari per questo passaggio: un piatto, garza sterile, forbici fini, forcep fini e bisturi.
Di solito usiamo questo tipo di piatto e garza sterile, ma anche altri prodotti come la piastra di Petri di plastica, la piastra di vetro, eccetera, possono essere adatti a questa procedura e qualsiasi tipo di garza sterile è adatto. Consigliamo tuttavia vivamente l'uso di questa forma di forcep e bisturi. Inoltre, utilizzare la piastra calda per mantenere la temperatura dei piatti contenenti tessuti Posizionare sotto il drappo sterile.
I tessuti corticali vengono immediatamente trasferiti nel piatto contenente mHTF. Scatta una foto con il nome del paziente per correlare con i dati del paziente. Registrare le dimensioni, lo spessore e le condizioni del tessuto.
Rimuovere il tessuto midollare residuo. Prima della frammentazione dei tessuti, rimuovere il tessuto midollare. Metti la corteccia sulla garza sterile.
Come mostrato nel video, la garza è inumidita con mezzo. Durante questa procedura, applicare il mezzo con una pipetta usa e getta prima che la superficie della corteccia sia asciugata. Rimuovere i tessuti residui con micro forbici fino a quando lo spessore raggiunge uno o due millimetri.
Nei pazienti con POR, i follicoli secondari si trovano più profondi di un millimetro dalla superficie della corteccia, quindi non rendere i tessuti meno di un millimetro di spessore. Tagliare un lato della corteccia di ogni tessuto in una striscia che misura uno per uno per cinque millimetri per l'analisi istologica per determinare la presenza di follicoli residui. Mettere questa striscia in tubo da 1,5 millilitri con mezzo di coltura e mantenere a quattro gradi Celsius fino al fissaggio.
Preparazione di cubi corticali ovarico. Dopo la rimozione del tessuto midollare, la corticale ovarica è frammentata per l'interruzione della segnalazione dell'ippopotamo. All'inizio, tagliare la corteccia in strisce una per una per 10 millimetri usando bisturi.
Quindi tagliare queste strisce in piccoli cubi cubi di un millimetro. Nel mezzo, il tessuto è scivoloso e difficile da tagliare. Per un facile taglio, tagliare le strisce premendo verso il basso sul bisturi piuttosto che tirandolo su di esso.
Dopo il taglio, contare il numero di cubi e preparare l'auto-innesto. Per evitare i cambiamenti di pressione osmotica nel mezzo, aggiungere il mezzo con moderazione prima dell'auto-innesto del tessuto. Per l'auto-innesto ovarico, l'uso di un dispositivo a forma di cannula consente un caricamento più semplice.
Questo passaggio contiene due passaggi. In precedenza, i frammenti ovarici venivano trapiantati uno per uno usando le forcep sotto laparoscopia. Tuttavia, ci vollero da tre a quattro ore per completare l'intervento chirurgico.
In questa procedura, usiamo un dispositivo a forma cannulare fatto di una siringa interna e di un cilindro esterno. Questa è una forma semplice e leggera. Inoltre, la punta di questo dispositivo è di forma rotonda.
Non ci sono punti taglienti che evitano danni al sito di trapianto. L'utilizzo di questo tipo di dispositivo consente di portare fino a 20-30 cubi al sito di impianto contemporaneamente. Ciò porta a un trapianto efficiente e a una riduzione dei tempi di intervento chirurgico.
Caricamento di frammenti corticali ovarico. Preparazione della cannula IVA. Preparare la cannula IVA e lavare questo dispositivo in mHTF.
Ripetere più volte il mezzo di aspirazione e scarico. Riempire la punta di un cannular aspirando circa 100 microlitri del mezzo. Questo per evitare che i cubi si esertino durante il caricamento dei frammenti di tessuto.
Caricamento di cubi corticali. Scegli un cubo con forcep fini e mettilo nella punta del cannular. Il numero di cubi auto-innestati dipende dalle dimensioni del sito di trapianto.
Ripetere il caricamento dei cubi uno per uno fino a raggiungere il numero di destinazione. Dopo aver caricato i cubi, passare la cannula al chirurgo con attenzione. Se il sito di innesto non è pronto, la parte del cannolare che contiene cubi ovarico deve essere tenuta dalle dita per evitare una diminuzione della temperatura dei cubi.
Abbiamo già riportato i risultati clinici dell'IVA senza farmaci. Si prega di fare riferimento al documento pubblicato sui risultati clinici. Questo protocollo di laboratorio richiedeva da 30 a 50 minuti per un paziente.
Il tempo medio è di 10-20 minuti per la frammentazione della corteccia ovarica e di 20-30 minuti per il caricamento di questi frammenti sulla cannula IVA. Questo dipende dalle dimensioni del tessuto, ma quasi tutti i pazienti possono essere finiti in questo tempo medio. Conclusioni. L'IVA senza farmaci è un nuovo approccio di trattamento dell'infertilità per i pazienti con POR con riserva ovarica in diminuzione.
Questi protocolli di laboratorio portano alla riduzione sia del tempo necessario per l'intervento chirurgico che della perdita di frammenti durante il trapianto. La tecnica di laboratorio dell'IVA senza farmaci potrebbe diventare la base della futura applicazione della coltura del tessuto ovarico per ottenere ovociti maturi senza innesto.
