Цель этого фильма – продемонстрировать процедуру нашего нового подхода к пациентам с дисфункцией яичников. Функция яичников постепенно снижается во время старения и некоторых патофизиологических состояний, включая аномалию кариотипа, аутоиммунные заболевания, химио- и лучевую терапию и операции на яичниках. Большинство женщин среднего возраста с низким оварианским резервом показали плохую реакцию яичников на стимуляцию яичников для получения зрелых ооцитов.
Кроме того, молодые пациентки с низким количеством антральных фолликулов также показали плохую реакцию яичников на стимуляцию яичников. Сохранение фертильности важно для сохранения потенциального OCS для будущей беременности. Для сохранения фертильности была установлена криоконсервация ооцитов.
Тем не менее, эти пациенты с плохим ответом яичников могли извлекать очень ограниченное количество ооцитов даже после надлежащей стимуляции яичников, что приводило к необходимости повторных дорогостоящих процедур для обеспечения достаточного количества ооцитов, чтобы гарантировать одного ребенка. Для решения этих проблем мы недавно разработали процедуру активации in vitro, IVA, которая позволяет нам стимулировать раннюю стадию фолликулов яичников к развитию до преантральной стадии фолликула. Оригинальная процедура IVA может способствовать росту первичного, первичного и вторичного фолликула путем фрагментации коры яичников, что приводит к нарушению передачи сигналов гиппопотамом.
Затем следует два дня культивирования с помощью сигнального стимулятора Akt. Эта процедура подходит для пациентов с POI с небольшим количеством остаточных фолликулов. Тем не менее, эта процедура является чрезмерным лечением для пациентов, которые имеют несколько вторичных фолликулов.
Для пациентов, у которых есть некоторые остаточные вторичные фолликулы, мы установили метод, называемый IVA без лекарств, и уже проверили возможность стимулирования роста вторичного фолликула только путем нарушения сигнального пути бегемота. У нас также было несколько успешных случаев доставки без лекарств IVA. Мы уже публиковали хирургическую процедуру препарата без препарата IVA и протокол последующей стимуляции яичников.
В этом видео мы представляем подробную информацию о лабораторных методах, необходимых для безнаркотатической ИВА. Мы набрали пациентов для безнаркотатической IVA на основе Болонских критериев. У пациентов может быть несколько вторичных фолликулов.
Сначала часть коры удаляли из одного или обоих яичников путем лапароскопии. Пациенты POR - это те, у кого были яичники среднего размера. У большинства пациенток мы извлекли только часть кортикальной ткани из яичников с одной или обеих сторон.
Извлеченные критические ткани немедленно переносились в культурную чашку, содержащую культурную среду с буфером HEPES, и рассекали эту маленькую ткань на мелкие кубики для нарушения сигнализации гиппопотама. Подробности процедуры будут показаны в этом видео. Сигнальный путь гиппопотама необходим для поддержания оптимального размера органа.
Этот путь состоит из нескольких отрицательных регуляторов роста. Как только передача сигналов гиппопотама нарушается, уровни фосфорилирования YAP, одного из отрицательных регуляторов роста, действующих в каскаде киназы, снижаются, а ядерные уровни YAP увеличиваются. YAP действует в согласии с транскрипционными факторами TEAD для увеличения фактора роста CCN.
С другой стороны, актиновая полимеризация глобулярного действия, G-актина, до нитевидной формы, F-актина, важна для поддержания формы клеток и передвижения. Ранее сообщалось, что индукция образования F-актина нарушает передачу сигналов гиппопотамом и вызывает чрезмерный рост в клетках HeLa человека. Ранее мы сообщали об усилении фрагментации яичников, увеличивающей образование F-актина, и это приводит к снижению уровня фосфорилирования YAP.
Это приводит к повышенной экспрессии фактора роста CCN. После разрезания эти кубики прививаются в оставшийся яичник. Эта процедура может способствовать остаточному росту вторичного фолликула и привести к увеличению количества зрелых яйцеклеток.
Непрекативная ИВА состоит из четырех этапов. Мы уже опубликовали хирургическую процедуру для безнаркотационной ИВА. Пожалуйста, обратитесь к этой литературе по извлечению коры яичников и аутоплантажности.
Здесь мы покажем подробные процедуры лабораторных методов, необходимых для безнаркотатической ИВА. На шаге первый мы покажем, как выполняется фрагментация коры яичников. На этапе два мы покажем, как загрузить коркальные кубики яичника в устройство для трансплантации, Здесь я покажу фрагментацию коры яичников.
Данное исследование было одобрено этическим комитетом нашего института, и все процедуры были проведены в соответствии с Кодексом этики Всемирной медицинской ассоциации. Фрагментация коры яичников. Для этого шага необходимы следующие инструменты: блюдо, стерильная марля, мелкие ножницы, тонкие щипцы и скальпель.
Мы обычно используем этот тип тарелки и стерильной марли, но другие продукты, такие как пластиковая чашка Петри, стеклянная тарелка и т. Д., Также могут быть подходящими для этой процедуры, и любой тип стерильной марли также подходит. Однако мы настоятельно рекомендуем использовать эту форму щипцов и скальпелей. Кроме того, используйте конфорку для поддержания температуры посуды, содержащей салфетки, поместите под стерильную драпировку.
Кортикальные ткани сразу же переносятся в блюдо, содержащее мХТФ. Сделайте снимок с именем пациента для корреляции с данными пациента. Запишите размер, толщину и состояние ткани.
Удалить остаточную ткань продолговатого мозга. Перед фрагментацией ткани удаляют ткань продолговатого мозга. Положите кору на стерильную марлю.
Как показано на видео, марлю смазчат средой. Во время этой процедуры нанесите среду с одноразовой пипеткой до того, как поверхность коры высохнет. Удалите остатки тканей микроципницами до тех пор, пока толщина не достигнет одного-двух миллиметров.
У пациентов с ПОР вторичные фолликулы расположены глубже одного миллиметра от поверхности коры, поэтому не делайте ткани толщиной менее одного миллиметра. Разрезать одну сторону коры каждой ткани на полоску размером один за другом на пять миллиметров для гистологического анализа для определения наличия остаточных фолликулов. Поместите эту полоску в 1,5-миллилитровую трубку с питательной средой и держите при четырех градусах Цельсия до фиксации.
Подготовка кортикальных кубиков яичника. После удаления ткани продолговатого мозга кора яичника фрагментируется для нарушения передачи сигналов гиппопотамом. Сначала разрезайте кору на одну за одной по 10 миллиметров полоски с помощью скальпеля.
Затем нарежьте эти полоски на один миллиметр кубиками небольших кубиков. В среде ткань скользкая и трудно поддался разрезанной. Для легкой резки нарежьте полоски, надавливая на скальпель, а не натягивая его.
После обрезки подсчитайте количество кубиков и подготовьте автокроплантаж. Чтобы избежать изменения осмотического давления в среде, добавьте среду в умеренных количествах перед аутоплантацией тканей. Для аутоплантата яичников использование устройства в форме канюли позволяет облегчить загрузку.
Этот шаг содержит два шага. Ранее фрагменты яичников пересаживали один за другом с помощью щипцов под лапароскопией. Тем не менее, потребовалось около трех-четырех часов, чтобы операция была завершена.
В этой процедуре мы используем устройство канюлярной формы, изготовленное из внутреннего шприца и наружного цилиндра. Это простая форма и легкий вес. Кроме того, наконечник этого устройства имеет круглую форму.
Нет острых точек, которые избегают повреждения места пересадки. Использование этого типа устройства позволяет одновременно довести до места имплантации до 20-30 кубов. Это приводит к эффективной трансплантации и сокращению времени операции.
Загрузка корковых фрагментов яичников. Приготовление канюли IVA. Подготовьте канюлю IVA и промыть это устройство в mHTF.
Повторить аспират и разгрузочную среду несколько раз. Заполните кончик канюляра, аспирируя около 100 микролитров среды. Это необходимо для того, чтобы кубики не вытягиваются во время загрузки фрагментов ткани.
Загрузка кортикальные кубики. Соберите куб мелкими щипцами и вставьте его в кончик каннуля. Количество самоквитых кубиков зависит от размера участка пересадки.
Повторяйте загрузку кубов один за другом, пока не достигнете целевого номера. После загрузки кубиков осторожно передайте канюлю хирургу. Если участок прививки не готов, часть канюляра, содержащую кубики яичника, следует удерживать пальцами, чтобы избежать снижения температуры кубиков.
Мы уже сообщали о клинических результатах безапрезивной ИВА. Пожалуйста, обратитесь к опубликованной статье о клинических результатах. Этот лабораторный протокол требовал от 30 до 50 минут для одного пациента.
Среднее время составляет от 10 до 20 минут для фрагментации коры яичников и от 20 до 30 минут для загрузки этих фрагментов в канюлю IVA. Это зависит от размера ткани, но почти все пациенты могут быть закончены в это среднее время. Выводы. Безмедикаментозная IVA - это новый подход к лечению бесплодия для пациентов с ПОР с уменьшающимся овариалистным резервом.
Этот лабораторный протокол приводит к сокращению как времени, необходимого для операции, так и потери фрагментов во время трансплантации. Лабораторная методика безмедикаментозной ИВА может стать основой будущего применения культуры ткани яичников для получения зрелых ооцитов без прививки.
