El objetivo de esta película es demostrar el procedimiento de nuestro nuevo enfoque a las pacientes con disfunción ovárica. La función ovárica disminuye progresivamente durante el envejecimiento y algunas condiciones fisiopatológicas incluyendo anormalidad del karyotype, enfermedades inmunes auto, quimioterapia y radioterapias, y cirugías ováricas. La mayor parte de mujeres de mediana edad con una reserva ovárica baja mostró respuesta ovárica pobre al estímulo ovárico para rendir los ovocitos maduros.
Además, los pacientes jovenes con un número bajo de folículos antrales también demostraron respuesta ovárica pobre al estímulo ovárico. La preservación de la fertilidad es importante ahorrar el OCS potencial para el embarazo futuro. Para la preservación de la fertilidad, el cryopreservation del oocyte fue establecido.
Sin embargo, estas pacientes pobres de la respuesta ovárica podrían recuperar un número muy limitado de ovocitos incluso después del estímulo ovárico apropiado, llevando al requisito de procedimientos costosos repetidos para asegurar un número suficiente de ovocitos para garantizar a un bebé. Para resolver estos problemas, recientemente hemos desarrollado la activación in vitro, procedimiento IVA, que nos permite estimular la etapa temprana de los folículos ováricos para que se desarrollen a la etapa del folículo preanual. El procedimiento original del IVA puede promover crecimiento primordial, primario, y secundario del folículo por la fragmentación ovárica de la corteza, llevando a la interrupción de la señalización del hipopótamo.
Esto es seguido por dos días de cultivo con estimulador de señalización Akt. Este procedimiento es conveniente para los pacientes del POI con pocos folículos residuales. Sin embargo, este procedimiento es un tratamiento excesivo para los pacientes que tienen folículos secundarios múltiples.
Para los pacientes que tienen algunos folículos secundarios residuales, establecimos el método llamado IVA libre de drogas y ya hemos probado la posibilidad de promover el crecimiento del folículo secundario interrumpiendo solamente el camino de la señalización del hipopótamo. También hemos tenido algunos casos exitosos de entrega por IVA libre de drogas. Ya hemos publicado el procedimiento quirúrgico del IVA libre de drogas y el protocolo de seguimiento de la estimulación ovárica.
En este video, presentamos los detalles de los métodos de laboratorio requeridos para el IVA libre de drogas. Se reclutaron los pacientes para un IVA libre de fármacos en función de los criterios de Bolonia. Los pacientes podían tener folículos secundarios múltiples.
Al principio, parte de la corteza fue quitada de uno o a ambos ovarios por laparoscopia. Los pacientes con POR son aquellos que tenían ovarios de tamaño mediano. En la mayor parte de los pacientes, extrajimos solamente la parte de los tejidos corticales de los ovarios en uno o ambos lados.
Los tejidos críticos extraídos fueron transferidos inmediatamente a un plato de cultivo que contenía el medio de cultivo con el almacenador intermediario de HEPES, y diseccionaron este pequeño tejido en los pequeños cubos para la interrupción de la señalización del hipopótamo. Los detalles del procedimiento se mostrarán en este video. La vía de señalización del hipopótamo es esencial para mantener un tamaño óptimo de los órganos.
Esta vía consiste en varios reguladores de crecimiento negativos. Una vez que se interrumpe la señalización del hipopótamo, los niveles de fosforilación de YAP, uno de los reguladores negativos del crecimiento que actúan en una cascada de quinasas, se disminuyen y los niveles nucleares de YAP se incrementan. YAP actúa en concierto con los factores transcripcionales TEAD para aumentar el factor de crecimiento ccn aguas abajo.
Por otro lado, la polimerización de actina de acción globular, G-actina, a la forma filamentosa, F-actina, es importante para el mantenimiento de la forma celular y la locomoción. La inducción previamente divulgada de la formación de la F-actina interrumpe la señalización del hipopótamo e induce crecimiento excesivo en células humanas de HeLa. Divulgamos previamente la formación ovárica de la F-actina del aumento de la fragmentación, y lleva a la disminución del nivel de fosforilación de YAP.
Conduce a una mayor expresión del factor de crecimiento ccn. Después del corte, estos cubos se injertan en el ovario restante. Este procedimiento puede promover el crecimiento del folículo secundario residual y conducir a un mayor número de ovocitos madurados.
El IVA libre de drogas consta de cuatro pasos. Ya hemos publicado el procedimiento quirúrgico para el IVA libre de drogas. Refiera por favor a esa literatura para la extracción y el auto-injerto de la corteza ovárica.
Aquí mostramos los procedimientos detallados de los métodos de laboratorio requeridos para el IVA libre de drogas. En el primer paso, mostramos cómo se realiza la fragmentación de la corteza ovárica. En el paso dos, mostramos cómo cargar los cubos corticales ováricos en el dispositivo para el trasplante, Aquí, mostraré la fragmentación de la corteza ovárica.
Este estudio fue aprobado por el comité ético de nuestro instituto, y todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial. Fragmentación de la corteza ovárica. Las siguientes herramientas requeridas para este paso: un plato, gasa estéril, tijeras finas, pinzas finas y bisturí.
Por lo general, utilizamos este tipo de plato y gasa estéril, pero otros productos como la placa de Petri de plástico, plato de vidrio, etcétera, también pueden ser adecuados para este procedimiento, y cualquier tipo de gasa estéril también es adecuado. Sin embargo, recomendamos encarecidamente el uso de esta forma de tórceps y bisturí. Además, utilice la placa caliente para mantener la temperatura de los platos que contienen tejidos Coloque debajo de la cortina estéril.
Los tejidos corticales se transfieren inmediatamente al plato que contiene mHTF. Tome una foto con el nombre del paciente para correlacionar con los datos del paciente. Registre el tamaño, el grosor y la condición del tejido.
Retire el tejido residual de la médula. Antes de la fragmentación del tejido, retire el tejido de la médula. Ponga la corteza en la gasa estéril.
Como se muestra en el video, la gasa está humedada con medio. Durante este procedimiento, aplique el medio con una pipeta desechable antes de que la superficie de la corteza se seque. Retire los tejidos residuales con micro tijeras hasta que el espesor alcance de uno a dos milímetros.
En pacientes con POR, los folículos secundarios se encuentran a un milímetro de la superficie de la corteza, por lo que no hacen que los tejidos sean inferiores a un milímetro de espesor. Corte un lado de la corteza de cada tejido en una tira que mida uno por uno por cinco milímetros para el análisis histológico para determinar la presencia de folículos residuales. Poner esta tira en tubo de 1,5 mililitros con medio de cultivo y conservar a cuatro grados centígrados hasta su fijación.
Preparación de cubos corticales ováricos. Después de la extracción del tejido de la médula, cortical ovárico se fragmenta para la interrupción de la señalización de hipopótamo. Al principio, corte la corteza en tiras de una por una por 10 milímetros usando bisturí.
A continuación, cortar estas tiras en un milímetro cubos pequeños en cubos. En el medio, el tejido es resbaladizo y difícil de cortar. Para un corte fácil, corte las tiras presionando hacia abajo sobre el bisturí en lugar de tirando de él.
Después del corte, cuente el número de cubos y prepare el autoinjerto. Para evitar los cambios de presión osmótica en el medio, agregue el medio con moderación antes del autoinjerto tisular. Para el autoinjerto ovárico, el uso de un dispositivo en forma de cánula permite una carga más fácil.
Este paso contiene dos pasos. Previamente, los fragmentos ováricos fueron trasplantados uno por uno usando el tórceps bajo laparoscopia. Sin embargo, la cirugía tardó entre tres y cuatro horas en completarse.
En este procedimiento, utilizamos un dispositivo de forma cannular hecho de una jeringa interna y un cilindro externo. Esta es una forma simple y ligera. Además, la punta de este dispositivo es de forma redonda.
No hay puntos agudos que eviten dañar el sitio del trasplante. El uso de este tipo de dispositivo permite llevar hasta 20 a 30 cubos al sitio de implantación a la vez. Esto conduce a un trasplante eficiente y a la reducción del tiempo de cirugía.
Carga de fragmentos corticales ováricos. Preparación de cánula IVA. Prepare la cánula IVA y lave este dispositivo en mHTF.
Repita el medio aspirado y de descarga varias veces. Llene la punta de un cannular aspirando unos 100 microlitros del medio. Esto es para evitar que los cubos se dibuyeran durante la carga de fragmentos de tejido.
Carga de cubos corticales. Coge un cubo con pórceps finos y ponlo en la punta de la cannular. El número de cubos autoinjertado depende del tamaño del sitio del trasplante.
Repita la carga de los cubos uno por uno hasta que alcance el número de destino. Después de cargar los cubos, pase la cánula al cirujano con cuidado. Si el sitio de injerto no está listo, la parte de la cannular que contiene cubos ováricos debe ser sostenida por los dedos para evitar una disminución en la temperatura de los cubos.
Ya hemos informado de los resultados clínicos del IVA libre de fármacos. Consulte el artículo publicado sobre los resultados clínicos. Este protocolo del laboratorio requirió 30 a 50 minutos para un paciente.
El tiempo promedio es de 10 a 20 minutos para la fragmentación de la corteza ovárica, y de 20 a 30 minutos para cargar estos fragmentos en la cánula IVA. Esto depende del tamaño del tejido, pero casi todos los pacientes pueden ser terminados en este tiempo promedio. Conclusiones. El IVA libre de drogas es un nuevo enfoque de tratamiento de la infertilidad para las pacientes con pornografía con disminución de la reserva ovárica.
Estos protocolos de laboratorio conducen a la reducción tanto del tiempo necesario para la cirugía como de la pérdida de fragmentos durante el trasplante. La técnica de laboratorio del IVA libre de fármacos podría convertirse en la base de la futura aplicación del cultivo de tejido ovárico para obtener ovocitos maduros sin injerto.
