これは、構造および機能解析のために肺を保存するための空気膨張と血管灌流固定の利点を組み合わせた安価な方法です。この技術の主な利点は、細胞の形態と肺の空域内の位置の両方の保存です。十分な膨張と固定を確保するために、気管にルアースタブアダプターを入れ、右心室に灌流針を入れる間は注意が必要です。
空気膨張装置を設定するには、水柱の注射器をリングホルダーに入れ、動物のプラットフォームから水柱の25センチメートルまでの垂直高さを測定します。水柱管の端部に空気室の栓コックに取り付け、空気室のメスのルアーから動物処理容器の栓コックにチューブを取り付けます。空気室へのキャップと動物処理容器の外側の栓コックが閉じられていること、および水柱から空気膨張室に通じる管の栓コックが開いていることを確認する。
その後、25センチメートルのマークに水で注射器を充填します。水は、空気室に注射器やチューブを通って流れます。圧力が均等化されると、水は流れなくなります。
インフレのために肺を準備するために、安楽死させたマウスの肋骨ケージの下の腹壁に1つの横切開を行い、股関節の上に第2の横腹壁切開を行う。内部切開部から上方切開に向かって中線に沿って切り、鈍いはさみを使用して、横隔膜の側面に慎重に切開を行います。肺は、横隔膜が穿刺されるとすぐに崩壊するはずです。
横隔膜に沿って横方向に切って胸腔を開き、胸骨に沿って胸骨をシフォイドプロセスからジャグラーノッチに、そして横方向に肋骨ケージの上に切断して心臓と肺を完全に露出させる。リブケージの側面を固定し、気管の上に首に中線の切開を行います。気管を取り囲む皮膚、筋肉、甲状腺、および結合組織を取り除き、曲面鉗子を使用して後部気管の下に縫合の2つの部分をスライドさせます。
1つの縫合糸を使用してインフレルアースタブアダプタを所定の位置に保持し、18ゲージを1インチの針で使用して気管に小さな穴を開けます。穴に20ゲージのルアースタブアダプターを挿入し、気管の周りの縫合線をすぐに遠位の巻き取り、ルアースタブの採用者が穴に入る場所に結びます。次に、動物を動物処理容器に移し、動物処理容器の内側のメスのルアーにルアースタブアダプターを取り付けます。
肺を膨らませるには、心臓の右心室に穿刺装置に取り付けられた5/8インチの針で25ゲージを置き、心臓から血液が流出し、肺を通る透過液の流れを促進するために腹部大動脈を切断する。動物処理容器の外側にある栓を開け、25センチの水で肺を5分間膨らませ、注射器の水位が速すぎないように注意します。肺のインフレの最後の分の間に、蠕動ポンプを毎分10ミリリットルの流量に変えなさい。
ヘパリン溶液は、動物にチューブを通してボトルから流れる必要があります。肺を5分間膨らませた後、ポンプをオフにして、パーフューザートをヘパリンから固定剤に切り替えます。水柱の注射器を20センチメートルに下げます。
気泡は、圧力が変化するにつれて水柱内を移動するのが普通です。シリンジの水位を確認してください。それは25センチメートルのマークでなければなりません。
その後、肺が25〜20センチメートルの水圧を収縮させ、10〜15分間毎分6.5ミリリットルの流量でポンプを再起動し、血管固定灌流を可能にします。膨張し、固定された肺組織の抽出のために、気管の周りの糸の2番目の部分をしっかりと結び付け、ルアースタブアダプタに遠位し、気管からルアースタブアダプタを取り外します。心臓から針を取り出し、鈍いはさみを使用して、肺を穿刺する後部の結合組織を切断し、肺を穿刺しないように注意して胸腔から肺と心臓を解放する。
慎重に肺から心臓を取り除き、50ミリリットルの円錐形チューブに固定剤の20〜25ミリリットルに肺を置きます。円錐形のチューブの開口部から気管を保持する縫合糸を引き、キャップの糸で縫合糸を固定します。その後、チューブを反転して、浮力のある空気膨張した肺が固定性で完全に水没し、標準的なプロトコルに従って組織学的研究のために肺を処理するようにします。
分離中に横隔膜が入ると、胸膜腔の完全性が廃止され、肺が崩壊する。25センチの水圧を適用すると、気管を介して空気が肺に入り、インフレが容易に観察されるはずです。肺が完全に膨張すると、過度に膨張することなく肺を膨らませるために、インフレ圧を20センチメートルに下げることができる。
気管結紮および胸郭からの除去後に肺を膨張させたままにするべきである。動物の準備中または肺抽出中に肺が穿刺された場合、デフレが起こる可能性があります。膨張した肺切片の組織学的分析は、従来の液体ベースのインフレを用いて固定された組織の気道内腔に存在する免疫細胞が非常に少ないことを明らかにした。
対照的に、炎症細胞は、空気膨張による血管灌流によって固定された組織の空域内に保存される。拡散固定による空気膨張の後、肺組織は、染色、免疫組織化学、免疫蛍光イメージングを含む組織学的技術を介した組織切片とその後の分析のためにホルマリンに埋め込まれ得る。
