Il s’agit d’une méthode peu coûteuse qui combine les avantages du gonflage de l’air et de la fixation par perfusion vasculaire pour préserver les poumons pour les analyses structurelles et fonctionnelles. Le principal avantage de cette technique est la préservation de la morphologie cellulaire et de l’emplacement dans les espaces aériens du poumon. Des précautions doivent être prises lors de la mise en place de l’adaptateur de talon de leurre dans la trachée et de l’aiguille de perfusion dans le ventricule droit pour assurer un gonflage et une fixation adéquats.
Pour installer l’appareil de gonflage de l’air, placez une seringue pour la colonne d’eau dans un porte-anneau et mesurez une hauteur verticale de 25 centimètres de la plate-forme animale à 25 centimètres sur la colonne d’eau. Fixez à l’extrémité du tube de la colonne d’eau au robinet d’arrêt de la chambre à air et fixez un tube du leurre femelle de la chambre à air au robinet d’arrêt du récipient de traitement des animaux. Vérifiez que le bouchon de la chambre à air et le robinet d’arrêt à l’extérieur du récipient de traitement des animaux sont fermés et que le robinet d’arrêt du tube menant de la colonne d’eau à la chambre de gonflage de l’air est ouvert.
Remplissez ensuite la seringue avec de l’eau jusqu’à la marque de 25 centimètres. L’eau s’écoulera à travers la seringue et le tube dans la chambre à air. Une fois la pression égalisée, l’eau cessera de couler.
Pour préparer les poumons à l’inflation, faites une incision latérale dans la paroi abdominale sous la cage thoracique de la souris euthanasiée et une deuxième incision latérale de la paroi abdominale au-dessus des hanches. Coupez le long de la ligne médiane de l’incision intérieure vers l’incision supérieure et utilisez des ciseaux contondants pour faire soigneusement une incision dans le côté latéral du diaphragme. Les poumons devraient s’effondrer dès que le diaphragme est perforé.
Couper transversalement le long du diaphragme pour ouvrir la cavité thoracique et couper de manière supérieure le long du sternum du processus xiphoïde à l’encoche du jongleur, et latéralement au-dessus de la cage thoracique pour exposer complètement le cœur et les poumons. Épinglez les côtés de la cage thoracique et faites une incision médiane dans le cou, au-dessus de la trachée. Retirez la peau, les muscles, la glande thyroïde et le tissu conjonctif entourant la trachée et utilisez une pince incurvée pour faire glisser deux morceaux de suture sous la trachée postérieure.
Utilisez un morceau de suture pour maintenir l’adaptateur de talon de leurre de gonflage en place et utilisez une aiguille de calibre 18 par un pouce pour faire un petit trou dans la trachée. Insérez un adaptateur de talon de leurre de calibre 20 dans le trou et attachez la suture autour de la trachée immédiatement distale à l’endroit où l’adoptant de la souche de leurre pénètre dans le trou. Ensuite, transférez l’animal dans le conteneur de traitement des animaux et fixez l’adaptateur de talon de leurre au leurre femelle à l’intérieur du conteneur de traitement des animaux.
Pour gonfler les poumons, placez l’aiguille de calibre 25 par 5/8ème de pouce attachée à l’appareil de perfusion tubulaire dans le ventricule droit du cœur et coupez l’aorte abdominale pour permettre au sang de s’écouler du cœur et pour favoriser l’écoulement du perfusate à travers les poumons. Ouvrez le robinet d’arrêt à l’extérieur du récipient de traitement des animaux et gonflez les poumons à 25 centimètres d’eau pendant cinq minutes, tout en faisant attention à ce que le niveau d’eau dans la seringue ne diminue pas trop rapidement. Pendant la dernière minute du gonflage pulmonaire, allumez la pompe péristaltique à un débit de 10 millilitres par minute.
La solution d’héparine doit s’écouler de la bouteille à travers le tube dans l’animal. Après avoir gonflé les poumons pendant cinq minutes, éteignez la pompe et passez le perfusate de l’héparine au fixateur. Abaissez la seringue de la colonne d’eau à 20 centimètres.
Il est normal que les bulles d’air se déplacent dans la colonne d’eau à mesure que la pression change. Vérifiez le niveau d’eau dans la seringue. Il devrait être à la marque de 25 centimètres.
Attendez ensuite une minute pour permettre aux poumons de se dégonfler de 25 à 20 centimètres de pression d’eau avant de redémarrer la pompe à un débit de 6,5 millilitres par minute pendant 10 à 15 minutes, perfusion fixative vasculaire. Pour l’extraction du tissu pulmonaire gonflé et fixe, attachez fermement le deuxième morceau de fil autour de la trachée, distale à l’adaptateur de tige de leurre et retirez l’adaptateur de tige de leurre de la trachée. Retirez l’aiguille du cœur et utilisez des ciseaux contondants pour couper le tissu conjonctif, postérieur au médiastin, pour libérer les poumons et le cœur de la cavité thoracique en prenant soin d’éviter de percer les poumons.
Retirez soigneusement le cœur des poumons et placez les poumons dans 20 à 25 millilitres de fixateur dans un tube conique de 50 millilitres. Tirez la suture qui maintient la trachée à travers l’ouverture du tube conique et fixez la suture par les fils du capuchon. Ensuite, inversez le tube pour vous assurer que les poumons flottants et gonflés à l’air restent complètement immergés dans le fixateur et traitent les poumons pour des études histologiques selon des protocoles standard.
Lorsque le diaphragme est entré pendant la dissection, l’intégrité de l’espace pleural sera abolie et les poumons devraient s’effondrer. Lors de l’application de 25 centimètres de pression d’eau, l’air pénètre dans les poumons par la trachée et le gonflage doit être facilement observé. Une fois que les poumons se sont complètement dilatés, la pression de gonflage peut être réduite à 20 centimètres pour garder les poumons gonflés sans surdistension.
Les poumons doivent rester gonflés après la ligature trachéale et le retrait du thorax. La déflation peut se produire si les poumons sont perforés pendant la préparation de l’animal ou l’extraction pulmonaire. L’analyse histologique des sections pulmonaires gonflées révèle que très peu de cellules immunitaires sont présentes dans la lumière des voies respiratoires des tissus fixés à l’aide de l’inflation traditionnelle à base de liquide.
En revanche, les cellules inflammatoires sont préservées dans les espaces aériens des tissus fixés par perfusion vasculaire avec gonflage de l’air. Après le gonflage de l’air avec fixation de la profusion, le tissu pulmonaire peut être incorporé dans le formoin pour la section des tissus et l’analyse ultérieure par des techniques d’histologie, y compris la coloration, l’immunohistochimie et l’imagerie immunofluorescente.
