Это недорогой метод, сочетающий в себе преимущества надувания воздуха и фиксации перфузии сосудов для сохранения легких для структурного и функционального анализа. Основным преимуществом данной методики является сохранение как морфологии клеток, так и расположения в пределах воздушного пространства легкого. Следует проявлять осторожность при помещении адаптера заглушки приманки в трахею и перфузионной иглы в правый желудочек, чтобы обеспечить адекватную инфляцию и фиксацию.
Для установки аппарата наддува воздуха поместите шприц для толщи воды в держатель кольца и измерьте вертикальную высоту от 25 сантиметров от платформы животного до 25 сантиметров на толщу воды. Прикрепите к концу трубки водяного столба к запорному крану на воздушной камере и прикрепите трубку от женской приманки воздушной камеры к запорному крану на контейнере для обработки животных. Убедитесь, что крышка воздушной камеры и запорный кран на внешней стороне контейнера для обработки животных закрыты, и что запорный кран на трубке, ведущий от толщи воды к воздушной инфляционной камере, открыт.
Затем наполните шприц водой до отметки 25 сантиметров. Вода будет течь через шприц и трубку в воздушную камеру. Как только давление будет выровняться, вода перестанет течь.
Для подготовки легких к инфляции делают один боковой разрез в брюшной стенке ниже грудной клетки усыпленной мыши, а второй боковой разрез брюшной стенки над бедрами. Вырежьте вдоль средней линии от внутреннего разреза к верхнему разрезу и с помощью тупых ножниц аккуратно сделайте разрез в боковой стороне диафрагмы. Легкие должны разрушиться, как только диафрагма будет проколота.
Разрезать поперечно вдоль диафрагмы, чтобы открыть грудную полость, и разрезать выше по грудине от меченого отроска до выемки жонглера, и латерально над грудной клеткой, чтобы полностью обнажить сердце и легкие. Прикрепить по бокам грудной клетки и сделать разрез средней линии в шее, над трахеей. Удалите кожу, мышцы, щитовидную железу и соединительную ткань, окружающую трахею, и используйте изогнутые щипцы, чтобы скользить двумя кусочками шва под задней трахеей.
Используйте один кусок шва, чтобы удерживать адаптер заглушки приманки на месте и используйте иглу 18 калибра на один дюйм, чтобы сделать небольшое отверстие в трахее. Вставьте адаптер заглушки приманки 20 калибра в отверстие и завяжите шов вокруг трахеи сразу же от того места, где приманка входит в отверстие. Затем переложите животное в контейнер для обработки животных и прикрепите адаптер заглушки приманки к женской приманке на внутренней стороне контейнера для обработки животных.
Чтобы надуть легкие, поместите иглу 25 калибра на 5/8 дюйма, прикрепленную к трубке перфузионного аппарата, в правый желудочек сердца и перережьте брюшную аорту, чтобы позволить крови стекать из сердца и способствовать потоку перфусата через легкие. Откройте запорный кран на внешней стороне контейнера для обработки животных и надувайте легкие на 25 сантиметров воды в течение пяти минут, заботясь о том, чтобы уровень воды в шприце не снижался слишком быстро. В последнюю минуту надувания легких включите перистальтический насос со скоростью потока 10 миллилитров в минуту.
Раствор гепарина должен течь из флакона через трубку в животное. После надувания легких в течение пяти минут выключите насос и переключите перфусат с гепарина на фиксатор. Опустите водяной столб шприцем до 20 сантиметров.
Это нормально, когда пузырьки воздуха перемещаются в толщу воды при изменении давления. Проверьте уровень воды в шприце. Она должна быть на отметке 25 сантиметров.
Затем подождите одну минуту, чтобы позволить легким сдуться от 25 до 20 сантиметров давления воды, прежде чем перезапускать насос со скоростью потока 6,5 миллилитра в минуту в течение 10-15 минут, сосудистая фиксаторная перфузия. Для извлечения надутой и неподвижной легочной ткани плотно завяжите второй кусок нити вокруг трахеи, дистальнее адаптера заглушки приманки, и извлеките адаптер заглушки приманки из трахеи. Извлеките иглу из сердца и используйте тупые ножницы, чтобы разрезать соединительную ткань, заднюю часть средостания, чтобы освободить легкие и сердце от грудной полости, заботясь о том, чтобы избежать прокола легких.
Осторожно извлеките сердце из легких и поместите легкие в 20-25 миллилитров фиксатора в конической трубке размером 50 миллилитров. Потяните шов, удерживающий трахею, через отверстие в конической трубке и закрепите шов нитями колпачка. Затем переверните трубку, чтобы убедиться, что плавучие, надутые воздухом легкие остаются полностью погруженными в фиксатор и обрабатывают легкие для гистологических исследований в соответствии со стандартными протоколами.
Когда диафрагма вводится во время рассечения, целостность плеврального пространства будет упразднена и легкие должны разрушиться. При применении 25 сантиметров давления воды воздух будет поступать в легкие через трахею и инфляцию следует легко наблюдать. Как только легкие полностью расширятся, давление инфляции может быть уменьшено до 20 сантиметров, чтобы легкие были надуты без чрезмерного расширения.
Легкие должны оставаться раздутыми после лигирования трахеи и удаления из грудной клетки. Дефляция может возникнуть, если легкие проколоты во время подготовки животного или извлечения легких. Гистологический анализ раздутых участков легких показывает, что очень мало иммунных клеток присутствует в просвете дыхательных путей тканей, зафиксированных с помощью традиционной инфляции на основе жидкости.
Напротив, воспалительные клетки сохраняются в воздушном пространстве тканей, фиксированных посредством сосудистой перфузии с надуванием воздуха. После инфляции воздуха с фиксацией обильной ткани легочное может быть встроено в формалин для срезания ткани и последующего анализа с помощью гистологических методов, включая окрашивание, иммуногистохимию и иммунофлуоресцентную визуализацию.
