流れの下で標的とする血管薬を研究するためのin Vitro 3D細胞培養動脈モデル

本プロトコルは、ヒト血管系内の疾患部位を標的とする薬剤キャリアの研究および開発のための新しいプラットフォームとして役立つ可能性がある。私たちの技術の主な利点は、ヒト複製3D動脈モデル内の薬物キャリアの蓄積の研究を可能にすることです。これは、血流を含む生理学的条件下で行われます。

このアプローチは、アテローム硬化性動脈を含む血管疾患の広い範囲の診断と治療のための薬物キャリアを最適化するために使用することができます。まず、患者または以前に研究したヒト頸動脈分岐の幾何学から画像を選択し、画像を使用して金型のコンピュータ支援設計モデルを作成することから始めます。3Dプリンタを使用してデザインを印刷し、一時的な印刷サポートを取り外し、モデルをアセトンですすいでから、サンドペーパーを使用して金型を研磨して滑らかにします。

サンディングの後、イソプロピルアルコールでモデルをすすいでプラスチックダストを取り除き、モデルを化学フードで2〜3時間乾燥させます。プラスチックの幻滅を容易にするために、透明なラッカーでモデルを3回スプレーし、ラッカーが塗布の間に1時間空気乾燥することを可能にする。最後のアプリケーションの後、ペイントブラシとラッカーを使用して、滑らかなプラスチックの透明な長方形のストリップをフレームの両側に接着し、モデルが下部に密封され、上部に開くようにします。

乾燥後、デシケータに金型を入れ、作りたてのシリコーンゴム溶液をゆっくりと開口部に入れます。混合物が透明になるまで気泡を取り除き、一晩デシケーターの中にカビを残します。混合物が完全に乾燥したら、透明なスライドを取り除き、プラスチックが完全に溶解するまで化学フードに48時間絶対アセトンでモデルを浸します。

細胞播種前に閉じ込められたアセトンを蒸発させるには、60°Cで少なくとも4日間モデルをインキュベートする。モデルに細胞をシードするには、まずモデルと2つの入口コネクタと出口コネクタを紫外線または放射線で滅菌します。20分後、シリンジを使用して、摂氏37度で2時間、1ミリリットルフィブロネクチンあたり100マイクログラムの4ミリリットルでモデルをコーティングする。

インキュベーションの終了時に、フィブロネクチン溶液を出口から取り出し、内皮細胞培地でモデルを洗浄する。シリンジを使用して、内皮細胞培地細胞懸濁液のミリリットル当たり2.5倍から6ミリリットルの内皮細胞の4ミリリットルでリンスモデルを充填し、細胞の均質な分布を確保するために、細胞の均質な分布を確保するために、細胞培養インキュベーター内の回転子に48時間モデルを固定します。インキュベーションの最後に、10ミリリットルのプラスチック注射器を使用してPBSでモデルを洗浄します。

4%パラホルムアルデヒドの4ミリリットルで細胞を15分間固定し、4ミリリットルの新鮮なPBSでモデルを摂氏4度で保存する前に、PBSでモデルを3回洗浄します。実験を開始する前に、出口管を使用して、蠕動ポンプに接続された振動ダンパーを培養頸動脈モデルの入口に接続し、チューブの一部を使用して2つの出口をマージします。次に、出口管を2つの出口管に分割し、各チューブにプラスチッククランプを追加します。

閉回路構成を設定するには、閉回路コンテナに300ミリリットルのPBSを追加し、それぞれBとCクランプを開いた状態でPBS充填容器の中に1つの入口と1つの出口チューブを入れ、もう1つの入り口チューブを蒸留水で満たされた1リットルの洗浄容器に入れ、もう1つの出口チューブをAとDクランプを閉じた空の1リットルの廃棄物容器に入れます。 それぞれ。頸動脈モデルをステレオ顕微鏡の下に置き、ポンプを毎分10回転の開始流量に設定し、毎分5回転の増分が4〜5分ごとに増加します。流量が毎分100回転に達したら、PBSのミリリットル当たり1ミリリットル当たり1.6マイクログラムの蛍光カルボキシ化ポリスチレン粒子を閉回路容器に加え、10秒ごとに関心領域を1時間半画像化します。

オープン・サーキット構成をセットアップするには、AとDのクランプを開き、BとCのクランプをすぐに閉じます。水の大部分は、1分間に100回転で洗浄容器から廃棄物容器に流れ込みます。水が完全に移動する前に、ポンプを停止し、入口の前と頸動脈モデルの出口の後にチューブクランプを閉じます。

適切なフィルタを使用して、対象領域でモデルの画像をキャプチャし、粒子の細胞への堆積および接着を示す。実験が完了したら、カスタマイズしたソフトウェア コードを使用して対象地域でキャプチャされた画像を分析し、イメージの名前を入力し、推定しきい値を設定します。その後、コードを実行します。

結果の画像と、画像内のパーティクルの数を調べます。この代表的な分析では、3d頸動脈モデルに播種した培養内皮細胞の写真顕微鏡写真を、明視野および蛍光共焦点顕微鏡イメージングで観察することができる。蛍光直径10ミクロンのガラスビーズは、3dモデルに播種し、再循環パターンを示し、モデル内の生理学的条件の模倣に成功したことを示唆した。

粒子沈着のイメージングにより、壁せん断応力が高い再循環領域の外側で、細胞に対する粒子の接着レベルが高いことが明らかになった。このプロトコルに従って、異なるヒト動脈モデル内の細胞の特異的結合動態およびコア培養を有する機能的な粒子を、モデルを改善し、特定の製剤を研究するために検討され得る。この技術は、薬剤キャリアの血管標的化を研究するための新しいプラットフォームを提供します。

私たちは最近、異なる病気の血管領域を標的にするように粒子の加量を調整する方法を示すためにそれを使用しました。