このプロトコルは、ムリン乳癌から一次癌関連線維芽細胞を単離および培養し、腫瘍微小環境を標的とするように設計された新規ナノ粒子をスクリーニングすることを可能にする。原発CAFは、腫瘍間質のインビトロ研究のための最も信頼性の高い、生理学的モデルを表す。このプロトコルでは、最適な歩留まりを達成する方法を説明します。
まず、腫瘍解離のための消化ミックスを調製し、チューブをしっかりと閉じた後、溶液中に3〜5ミリメートルの腫瘍断片を浸します。チューブを逆さまにして、腫瘍のすべての部分がキャップに向かってチューブの底にあることを確認します。次に、チューブを適切なハウジングの機械的解離器に取り付け、特に厳しい腫瘍のために設計された解離プログラムを実行します。
走った後、チューブを取り外し、逆さまに置き、穏やかな揺れで40分間摂氏37度でサンプルをインキュベートします。その後、適切なハウジングの解離剤にチューブを再び取り付け、硬い腫瘍に対する解離プログラムを2回実行し、手順の最後に大きな組織片が残らないようにします。50ミリリットルチューブ内の40ミクロンの細胞ストレーナーを通してサンプルをフィルターします。
その後、フィルターをRPMI 1640培地と遠心分離機の10ミリリットルで洗浄します。遠心分離後、PBEバッファー内のペレットを再懸濁し、PBS、0.5%BSA、および2ミリモルEDTAで構成し、トリパンブルーで細胞をカウントする。滅菌二重蒸留水で20X結合バッファーストック溶液を希釈することにより、死細胞除去結合バッファーを修復します。
1X結合バッファーと遠心分離機の 5 ミリリットルで細胞を洗浄します。.遠心分離後、死細胞除去マイクロビーズを0.1ミリリットルで7番目の細胞まで10ミリリットル再懸濁し、室温で15分間インキュベートする。インキュベーション中に、ボンネットの下に磁気スタンドを用意し、先端を下に向けて強磁性分離カラムを吊り下げます。
0.5 ミリリットルのコールド バインディング バッファーで列を平衡化し、溶液が流れるまで待ちます。インキュベーション後、400マイクロリットルのコールド結合バッファーをビーズおよび細胞懸濁液に加えます。カラムに全容を積み込み、15ミリリットルのチューブで排水を集めます。
0.5ミリリットルのコールドバインディングバッファーでカラムを4回洗浄し、同じチューブ内の総排水量を収集します。非癌関連線維芽細胞の枯渇については、PBSで湿らせた70ミクロンの細胞ストレーナーを用いて細胞懸濁液を濾過し、細胞を遠心分離する。上清を取り除き、冷たいPBEバッファーの80マイクロリットルにペレットを再懸濁します。
非腫瘍関連線維芽細胞枯渇カクテルの20マイクロリットルを追加します。よく混ぜ、暗闇の中で15分間摂氏4度でサンプルをインキュベートします。ビーズでのインキュベーション時に、磁気スタンドに強磁性破壊カラムを用意します。
2 ミリリットルの冷たい PBE バッファーで列を平衡化し、溶液が流れるまで待ちます。インキュベーション後、ビーズと細胞懸濁液に400マイクロリットルのバッファーを加えます。カラムに全容を積み込み、15ミリリットルのチューブで排水を集めます。
PBEを2ミリリットルでカラムを2回洗います。同じチューブに総流出を収集し、排水を遠心します。癌関連線維芽細胞の陽性選択のために、80マイクロリットルの冷たいPBEバッファーのペレットを再懸濁させる。
次いで、腫瘍関連線維芽細胞マイクロビーズの20マイクロリットルで、暗い状態で15分間摂氏4度でサンプルをインキュベートする。インキュベーション時に磁気スタンドに強磁性分離カラムを用意し、0.5ミリリットルの冷たいPBEバッファーで平衡化します。インキュベーション後、ビーズと細胞懸濁液に400マイクロリットルのPBEを加えます。
ボリューム全体をカラムにロードし、ラベルなしの細胞を15ミリリットルのチューブに流します。0.5ミリリットルのPBEバッファーでカラムを3回洗浄し、同じチューブ内の総排水量を収集します。磁石から柱を取り出し、1.5ミリリットルのチューブに入れる。
PBEを1ミリリットルのPBEをカラムに追加し、すぐにプランジャーを列に押し込んでセルをフラッシュします。遠心分離後、適切なDMEMの体積で細胞ペレットを再懸濁し、細胞を組織培養プレートに播種する。細胞密度を顕微鏡で確認し、プレートを摂氏37度、炭酸ガス5%にして細胞が付着して成長できるようにします。
4T1ルシメラーゼ細胞を雌マウスの乳腺脂肪パッドに注入すると、移植の5日後に検出可能な腫瘍塊の増殖につながった。CAF単離に適した犠牲ウィンドウを見つけるために、一方でより高い腫瘍サイズと生物発光イメージングと、一方で新たな腫瘍潰瘍および壊死の間で最適な妥協が求められた。20日目は、分離プロセスの後、細胞回復を最適化する時間ポイントとして設定した。
収集された生存細胞のパネル、非腫瘍関連線維芽細胞の枯渇、および腫瘍関連線維芽細胞の濃縮から、CAFの集団を分離するためにさらに2つの通路が必要であった。CAF細胞は、線維芽細胞の典型的な大きな紡錘形形態を明らかにし、4T1腫瘍細胞とは異なっていた。FAP発現は5つの節を超えて、主要なCAF培養が元の特徴を維持していることを確認した。
マイクロビーズを用いたインキュベーションの持続時間および温度が維持されなかった場合、分離培養物の中に異なる形態を有するクローンが見出された。これらの汚染物質細胞は、より速く成長し、主要なCAF培養物に勝った。ヒトフェリチンHfn-FAP機能性ナノドラッグと結合するCAFは、裸HFNと比較して1対1、および1対5の抗体断片濃度を3倍に増加させた。
反対に、腫瘍4T1細胞については、裸HFNは機能的なHFNよりも高い結合を示した。分離されたCAFの不純物の収率を高めるために、バッファーを冷たく保ち、ビーズでインキュベーション時間を尊重し、最終濃縮ステップの前にカラムあたり最大4つの腫瘍を引き上げます。分離されたCAFは、生体内実験の前臨床を進める前に、結合、取り込み、および薬理学的有効性の期間に複数の候補ナノ医薬品をスクリーニングするために使用することができる。
CAF単離により、ナノ粒子を使用して腫瘍微小環境を標的にできるかどうかをテストすることができました。したがって、化学療法との相乗効果で働く新しい標的療法への道を開く。
