O9-1細胞株は、インビトロで神経堤細胞を研究するための非常に有用なツールです。それは研究の様々な使用の応用の広い範囲で使用するための大きな可能性を秘めている。O9-1細胞は、簡単にアクセスできるなどの明らかな利点を持ち、実験に十分な数の細胞を迅速に取得し、神経堤細胞のインビトロ研究に優れた強力な方法となっています。
まず、テキストプロトコルに従ってO9-1細胞培養用の基底培地を準備します。次に、基底培地を濾過し、それをホイルで包んで光から保護します。この後、テキストプロトコルに従って、活性化されたSTOセルから条件付き基礎培地を収集します。
まず、氷上の基質膜マトリックスのアリコートを2時間解凍する。その後、10%FBSで濾過されたDMEMで基膜マトリックスを希釈し、0.5mg/mlの最終濃度にします。プレートに基膜マトリックスを室温で1時間コーティングします。
次いで、プレートを傾けながら基部膜マトリックスを吸引する。30°Cで30分間乾かします。プレートに基膜マトリックスを追加する場合は、細胞特性を維持し、実験の間に不必要な変動を避けるために、溶液が均一にウェルを覆っていることを確認してください。
37°Cの水浴にクライオバイアルを置くことによってO9-1細胞を回復する。溶液が完全に液体に変わるまで、バイアルをゆっくりと旋回します。この後、細胞溶液をクライオバイアルから15ml遠心管に移します。
10%FBS の DMEM を 5 巻追加して、セルを再中断します。180 Gsで3分間細胞を遠心分離し、次にスーパーナテントを吸引し、ペレットを乱さないよう注意する。次に、LIFおよびBFGFを補充した条件付き基底培地中のペレットを再懸濁する。
6つのウェルプレートに細胞を播種し、プレートを攪拌して細胞を均等に播種します。プレートを攪拌するとき、プレートを渦巻くと細胞が中心に向かって集中するので、水平および垂直にそうしてください。そして、これらの細胞が一晩標準的な細胞培養インキュベーターに付着し、成長することを可能にする。
メディアを変更する前に、セルが接続されていることを確認してください。O9-1細胞が80%合流に達すると、基質膜マトリックスを解凍し、先に述べたように基部膜マトリックス被覆板を調製する。次に、膜マトリックスにLIFとBFGFを添加した基底培地を添加します。
2mlのDPBSでウェルを2回やさしくすすります。その後、セルを摂氏37度で0.05%トリプシンEDTAの1mlで3分間解化する。ウェルの表面全体に液体を繰り返しピペット化して、同量のDMEMを10%FBSで中和します。
次いで、細胞溶液を遠心分離管に移す。そして、180 Gs.Aspirateで3分間遠心分離機細胞のペレットを乱すことなくスーパーナテントを吸引する。次に、LIFおよびBFGFを補ったコンディション基底培地を穏やかにピペットすることにより細胞ペレットを再懸濁する。
前述のように、コーティングされたプレートに細胞を播種します。次いで、細胞を標準的な細胞培養インキュベーターに結合および増殖させる。まず、テキストプロトコルに従って2倍の凍結媒体を準備する。
その後、培地を濾過滅させる。プレートの壁をDPBSで2回リンスし、細胞を失わないように穏やかにピペットします。次に、37°Cで0.05%トリプシンEDTAで細胞を3分間解離します。
10%FBSとDMEMの同じ量でトリプシンを中和します。プレートの内容物を遠心分離管に移し、遠心分離機を180Gsで3分間移動し、次にスーパーナテントを吸引し、PBS2mlを加え、ペレットを再懸濁させる。細胞溶液をもう一度遠心分離し、スーパーナテントを吸引する。
必要に応じてチューブ内の基底メディアの量を調整し、同量の2倍の凍結媒体を追加します。次に、ラベル付きクライオバイアルにセルを移します。蓋付きのポリスチレンボックスの中にクライオバイアルを入れて、少なくとも24時間摂氏80度でゆっくりと冷却します。
O9-1細胞でSIRNAノックダウンを実行するには、細胞を回収して播種します。適量の無血清培地でリポソームを希釈する。次に、テキストプロトコルに従って無血清培地中のSIRNAを希釈する。
この後、メーカーの指示に従って、希釈したリポソームに希釈したSIRNAを追加します。溶液をピペットで混ぜ、室温で5分間インキュベートする。次に、細胞に適切な量のSIRNA脂質複合体を加える。
次に、標準的な細胞培養インキュベーターで24時間培養する。O9-1細胞は、特定の分化培養条件下で異なる細胞タイプに分化することができる。O9-1細胞を破骨形成細胞に分化するために、テキストプロトコルに従って骨形成分化培地を調製する。
最後に、免疫染色により、分化した破骨形成細胞の破骨形成マーカーを検出する。O9-1細胞を平滑筋細胞に分化するために、テキストプロトコルに従って分化培地下で培養し、平滑筋アクチン免疫染色による分化を評価した。このプロトコルでは、O9-1細胞におけるヤップ機能喪失を研究するためのノックアウトとノックダウン実験の両方が行われた。
平滑筋細胞分化条件下で, ほとんどの野生型 O9-1 細胞は平滑筋アクチン正平滑筋細胞を生み出しました。.しかし、Yapヌル細胞は一般的にSMA陽性平滑筋細胞に分化できなかった。これは、Yapが平滑筋細胞への神経堤細胞の分化において重要な役割を果たしていることを示す。
この手順を試みる際には、O9-1 細胞ラインを慎重に処理する必要があります。細胞解離には、基底膜マトリックスを適切に希釈して使用し、0.05%トリプシンを使用してください。O9-1細胞培養の準備中に、マイトマイシンcを使用することは非常に危険であり、ラボコートや手袋を着用するなどの予防措置は、常にこの手順を実行する際に取られるべきであることを忘れないでください。
