一般にPUREシステムとして知られている組換え無細胞タンパク質発現系のためのこのプロトコルは、必要なタンパク質精製を合理化するために細胞培養および細胞精製を利用する。これにより、時間と労働要件が大幅に最小化されます。OnePot法は、費用対効果が高いだけでなく、時間効率も高いことが証明されています。
それは、数週間から3営業日に準備時間を削減します。これにより、PURE無細胞プラットフォームは世界中のより多くの研究所にアクセス可能になり、合成細胞フリー生物学のためのこの本当に強力なプラットフォームを実装するのに役立ちます。始める前に、すべての株がそれぞれのタンパク質をうまく発現していることを確認してください。
まず、2ミリリットルのセファロース樹脂を用いてテキスト原稿に記載されているOnePotタンパク質精製用カラムを準備し、そのカラムに硫酸ニッケルをチャージします。20マイクロリットルのアンピシリンとLB培地を20ミリリットル組み合わせてスターター培養を準備します。滅菌96深井戸プレートの35個の井戸に300マイクロリットルの培地を加えます。
伸び率が熱不安定、またはEFTUを除き、それぞれの株でそれぞれの株を接種し、通気性のある膜でプレートを密封する。EFTU培養の場合、LB培地を含むアンピシリンを3ミリリットルのアンピシリンをスナップキャップ付き14ミリリットル培養チューブに接種する。EFTU培養の約3ミリリットルは、1つのOnePot発現培養に十分である。
一晩毎分260回転で揺れながら、摂氏37度でインキュベートします。翌日、500ミリリットルのLB培地と500マイクロリットルのアンピシリンを無菌バッフルフラスコに移す。1,675マイクロリットルのEFTU培養液と深層ウェルプレートから各培養物の55マイクロリットルでOnePot PURE培養を接種します。
1分間に260回転の揺れで37°Cで2時間培養するか、または培養の光学密度が0.2〜0.3に達するまで培養をインキュベートする。0.1ミリモルIPTGの500マイクロリットルで培養を誘導し、さらに3時間増殖させる。摂氏4度、G220倍10分間、摂心度3、220倍で細胞を収穫し、さらに使用するまでマイナス80度で細胞ペレットを貯蔵する。
3日目に、精製に必要なバッファの量を測定し、テキストに示されているように、それらのすべてにTCEPを追加します。将来の精製のために、TCEP なしで残りのバッファーを摂氏 4 度で保管してください。30ミリリットルのバッファーAで荷電カラムを平衡化し、25ミリリットルのバッファーAが通過した後、カラムを底部から閉じます。
細胞を解凍し、血清学的ピペットを使用して、130ワットのプローブを使用して細胞を7.5ミリリットルのバッファーA.Lyseで再懸濁させます。超音波処理が成功した場合、ソリューションは暗くなります。細胞を氷の上に置き、チューブに触れることなく十分な深さをプローブに置くようにしてください。
21、130倍Gで摂氏4度で20分間遠心分離して細胞の破片を取り除き、氷の上にライセートを保ちます。平衡化された列に上澄み剤を追加します。上から列を閉じ、漏れがないことを確認します。
チューブ回転器を使用して回転下で摂氏4度で3時間カラムをインキュベートします。カラムから非結合成分をエルトし、25ミリリットルのバッファーAで洗浄し、25ミリモルイミダゾールバッファーの25ミリリットルでカラムを洗浄します。450ミリモルイミダゾール緩衝液の5ミリリットルでタンパク質をエル化し、溶出したタンパク質を常に氷の上に保ちます。
25ミリリットルのHTバッファーで溶出液を希釈し、氷の上に混合物を保ちます。15ミリリットルの遠心フィルターに15ミリリットルを加え、1.5ミリリットルの体積に濃縮します。残りの15ミリリットルを濃縮液でフィルターに加え、もう一度1.5ミリリットルに濃縮します。
濃縮サンプルにHTバッファーの10ミリリットルを追加し、1ミリリットルに濃縮.濃縮サンプルを回収し、同量のストックバッファBを追加し、さらに使用するまでマイナス80°Cで保存します。バッファー交換中に、テキストで指定されたとおりに列を復元します。
4日目に、ブラッドフォードアッセイを用いてタンパク質濃度を測定する。0.5キロダルトンカットオフ遠心フィルターの0.5ミリリットルを1ミリリットルあたり20ミリグラムに濃縮します。SDS ページを使用して OnePot PURE タンパク質組成を確認します。
2.5マイクロリットルの水を2つのX Laemmliバッファーの10マイクロリットルと混合した7.5マイクロリットルの水で希釈し、5マイクロリットルと2.5マイクロリットルのサンプルをゲルにセットします。テキストで指定されたとおりに SDS ページを実行します。反応のためにDNAの2〜10ナノモルを使用して、スプレッドシート内の対応する黄色の細胞内のDNAの濃度と長さを記入します。
所望の総反応量をマイクロリットルで満たします。必要な試薬を冷凍庫から取り出し、氷の上で解凍します。次に、計算された量の水、DNAおよびエネルギー溶液をPCRチューブの片側または384ウェルプレート上のウェルの片隅にピペットします。
PCRチューブの反対側または384ウェルプレートの反対側の角にタンパク質およびリボソーム溶液の計算量をピペットします。約30秒間回転し、反応成分を合合させます。プレートリーダーの実験中の蒸発を防ぐには、35マイクロリットルの液体ワックスを加え、透明なシーラントでプレートを密封します。
37°Cで最低3時間インキュベートします。プレートリーダーで読み出しを行う場合は、必要な波長での蛍光強度を2分ごとに測定します。OnePotタンパク質調製のために続いて使用されるすべての個々の株における過剰発現が図示される。
最終的なOnePot PUREタンパク質溶液の全体的な組成をSDSページで分析した。EFTUは、予想通り他のタンパク質に比べて高濃度で存在することが顕著である。Hisタグ付きまたはタグなしリボソームと組み合わせたOnePotタンパク質溶液の合成収率を、eGFP蛍光を時間の経過とともにモニタリングして分析した。
緑色リストtRNA in vitro標識システム、またはクマシ染色を用いて標識した3種類のタンパク質の発現レベルを、SDSページゲルで分析した。機能性PUREシステムの場合、すべての株がそれぞれのタンパク質をうまく発現することが絶対に重要です。この技術は、生物学的システム工学へのPUREシステムの実装を容易にし、新しい遺伝子ネットワーク、分子診断、治療薬および教育キットの開発を可能にする。
