グルタミン酸ニューロンと小児の高品位グリオーマ細胞の微小流体デバイスへの共培養による電気的相互作用の評価

悪性グリオーマ細胞とその周囲のニューロンとの相互作用が関心を集めています。ここでは、インビトロモデルの共同培養由来皮質グルタミン酸ニューロンと腫瘍細胞の開発を示す。多電極アレイに結合された共培養に使用されるマイクロフルディックデバイスは、異なる細胞タイプの研究を可能にし、培養の異なる時点で電気活動記録を行う。

この方法は、機能および機械学的研究および小児のハイグレードグリオーマ細胞の移動およびニューロンとの相互作用を妨げ薬理学的薬剤の効果を分析するのに特に有用である。製品化されたヒトIPS由来皮質グルタミン酸ニューロンの培養を開始するために、マイクロ流体デバイスの入口および出口貯留部をピペット吸引によって空にし、デバイスチャネルのみを培地で満たさせる。培地中の1ミリリットルの懸濁液あたり650万個のヒトIPS細胞の10マイクロリットルを加えてヒトIPS細胞にシードを入れ、デバイスを15分間ボンネットの下に入れて細胞を取り付けます。

15分後、インレットと出口の両方のリザーバーに50マイクロリットルの4つの培養培地を充填し、その後、23日間摂氏37度と5%の二酸化炭素で細胞を維持するためにインキュベーターにデバイスを移します。テキストに記載されているとおり、3 ~ 4 日ごとにメディアを交換します。細胞を数え、標準的な位相コントラスト顕微鏡を用いて生存率を評価するには、4日目、21日目、23日目に顕微鏡写真を撮ります。

DMEMおよびF-12グルタマックスにおけるUW479およびBT35細胞株の両方を細胞培養フラスコにおいて10%の胎児ウシ血清を補充した。実験を通してノルモキシ条件で摂氏37度で制御された環境下で細胞培養を維持する。各細胞株が80%の合流性に達するのを観察してください。

21日目にグルタミン酸細胞の培養後、UW479およびBT35細胞をトリプシン化して共培養を開始する。トリプシン化されたUW479およびBT35細胞を、各専用のマイクロ流体デバイスの成熟した付着性グルタミン酸ニューロンの上にシードします。摂氏37度の制御された環境下で2日間、グルタミン酸ニューロンD11および培地に対して5%の二酸化炭素を共培養します。

画像解析ソフトウェアで分析された顕微鏡写真を使用して小児の高等神経膠腫細胞を数え、その生存率を評価し、細胞の割合を計算する。記録装置にMFDを入れ、市販のソフトウェアを使用して、グルタミン酸ニューロンの電気生理学的記録を21日目に行う。小児のハイグレードグリオーマ細胞を播種する前に、共培養に平行して制御として培養した分化されたグルタミン酸ニューロンの第2の電気生理学的記録を行う。

23日目に、共培養の2日後に別の電気生理学的記録を行う。ヒトIPS由来の皮質グルタミン酸細胞は、ネスチン、SOX2、代謝性グルタミン酸受容体II、およびVGLUT1免疫染色を用いて特徴付け、評価された。ネスチンは中間フィラメントタンパク質であり、未分化CNS細胞で発現した。

SOX2は、CNSにおける神経上皮の未分化細胞においても発現した。ネスチンとSOX2陽性細胞の割合は4日目から21日目まで減少し、グルタミン酸細胞の分化状態を確認した。顕微鏡画像は、微小流体デバイス全体のグルタミン酸ニューロンの進行分布を明らかにした。

BT35とUW479を培養に添加すると、21日目にグリオーマ細胞播種後に浮遊細胞が存在することが観察され、23日目まで徐々に消失し、装置中に付着した。BT35およびUW479の生存細胞の割合は同等であり、患者由来細胞株を適切に使用できることを暗示した。培養23日目のスパイク検出およびラスタプロットは、小児の高級グリオーマ細胞を添加した後の電気的活性の増加を示した。

ニューラルネットワーク活性のシンクロニシティをモニタリングするために、BT35またはグルタミン酸ニューロンにおける瞬間的な発火率を記録した。個々に培養したグルタミン酸ニューロンと共培養型グルタミン酸ニューロンとの間の電気的活性の差は、23日目に有意であった。さらなる方法論的開発には、バースト解析を伴うネットワークの機能的評価およびネットワークの特殊な時間的相互相関が含まれ得る。

現在、研究者は、小児の高等神経膠腫腫瘍株と高PSCニューロンの相互作用と薬理学的標的化を探求する有望なツールを持っています。いくつかの腫瘍ラインといくつかのニューロンタイプが使用される可能性があります。