このプロトコルは、ゲノム特性評価のためのスクリーニングインターフェースから細胞を迅速に分離するように設計されており、この機能は、マクロ的に観察可能な細胞特徴とゲノム情報を組み合わせることができるので重要です。スクリーニングインターフェースから標的菌細胞を、この技術を用いて、操作的に簡単な方法で高い空間位置で単離することができる。ヒドロゲルは、他のスクリーニングインターフェースで実施することができる。
ヒドロゲル材料はマイクロ流体装置からの細胞のオンデマンド検索のためのマイクロ流体チャネルに容易に組み込むことができる。まず、目的の細胞密度で架橋バッファーを接種します。12.5マイクロ遠心分離管に12.5マイクロセントリフュージチューブのクロスリンクバッファーと5.6マイクロリットルのPEG ONBジアクリレート溶液を加えて、ヒドロゲル前駆体溶液を調製します。
そして最後に、6.9マイクロリットルの前腕PEGチオール溶液を混合物に加える。ヒドロゲル前駆体溶液の細胞カプセル化の場合、薄くしたベースカバーリップをきれいなペトリ皿の上に置き、カバースリップの反対側の2つのスペーサーに2つのスペーサーを置きます。スペーサーをペトリ皿にテーピングして、ベースカバースリップのスペーサーを固定します。
非反応性パーフルオロキル化ガラススライドに前駆体溶液の所望の容積を加えた後、スライドをベースカバースリップに置き、ヒドロゲルの形成を室温で25分間完了させます。ゲル化が完了したら、パーフルオロアルキル化ガラススライドを静かに取り除きます。抗生物質を補ったATGN培地を含む60~15ミリのペトリ皿に基質を入れる。
細菌細胞懸濁液の種子700マイクロウェルアレイ基板上に0.1のOD 600と、pH 8のリン酸緩衝生理食塩水ATGNの12.5マイクロリットルを使用して以前に示したようにヒドロゲル前駆体溶液を作る。ピペット12.5マイクロローサー溶液を非反応性パーフルオロアルキル化ガラススライド上に置き、細胞を接種したマイクロウェルアレイ基板の2つの反対側に2つの38マイクロメートルのスチールスペーサーを配置する。次に、前駆体溶液液滴でパーフルオロアルキル化ガラススライドを反転し、マイクロウェル基板の中央に液滴を置く。
室温で25分間のインキュベーション後にヒドロゲルが形成されたら、マイクロウェル基板からガラススライドを静かに取り出し、抗生物質を補ったATGN培地を含むペトリ皿に基板を入れます。サンプルを PDMS ホルダに入れ、サンプルの上に定義された培地を加えて、サンプルの脱水を防ぎ、放出された細胞にキャリア溶液を提供します。キャリブレーションミラーを位置に持ち込んだ後、顕微鏡の焦点を調整してヒドロゲルまたはマイクロウェルアレイ内のコロニーの鮮明な画像を取得し、目的のコロニーまたはウェルを識別するために検査します。
ここでは、カメラビューがサンプル内のコロニーを示しながら光パターンを設計し、細胞抽出のための異なるパターンをテストし、定義されたパターンを保存します。次に、セッションコントロールセクションを選択し、パターン照明ツールの製品名でタイトルのタブの下に保存されたシーケンスを追加します。パターンを刺激するオプションを選択して、必要な露出位置を表示および調整します。
次に、LED制御タブで光強度を60%に、露出時間を40秒に調整し、露光プロセスを開始します。リアルタイムおよびブライトフィールドモードでヒドロゲルの劣化を監視し、セルの放出を確認します。放出された細胞を集めるには、顕微鏡フィルターをブライトフィールドからTRITCに変更し、試料の露出した領域を肉眼で可視化します。
露出した領域が見つかったら、照射された場所にチューブの端部を置き、顕微鏡フィルターをブライトフィールドに戻してリアルタイムで細胞の検索を監視します。チューブの反対側に取り付けられたシリンジを使用して、放出された細胞を含む溶液の200マイクロリットルを慎重に引き出し、DNA分析またはメッキのために溶液を1.5ミリメートルの遠心分離管に移します。バルクヒドロゲルからの細胞抽出には異なるUV光マイクロパターンが使用され、放出された細胞の形態に影響を与えた。
リングパターンにおけるUV露光により、コロニー全体が保護PEGヒドロゲルに封入された放出が生じた。対照的に、コロニーの一部または全部をUV光にさらすことによって、細胞は凝集細胞クラスターとして、または自由な個々の細胞として抽出することができる。ヒドロゲルの細胞播種密度と厚さは、細胞カプセル化にとって重要です。
より薄いヒドロゲルは、最小限のコロニーの重複を有する微小コロニーをもたらし、厚さの増加したヒドロゲルはコロニーを重なり、複数のコロニーの抽出をもたらす可能性がある。コロニーの重なりは、光パターンの2次元的性質による抽出時に交差汚染を引き起こす可能性があります。トップコロニーが標的にされたとき、基礎となるコロニーもそれと共に抽出された。
また、細胞生存率に対する多様なUV光マイクロパターンの効果も評価した。マイクロコロニーが円形またはクロスパターンのいずれかで制御された用量のUV光にさらされたとき、細胞回復およびDNA純度は影響を受けなかった。このアプローチを用いてマイクロウェルアレイから細胞を正常に取り出し、代表的な共焦点顕微鏡画像から明らかであり、円形および環状パターンで照射すると、細胞はそれぞれのパターンで除去された。
マイクロウェルアレイから抽出した後、細胞の生存率とDNA量を評価した。暴露パターンは生存細胞数もDNAの質にも影響を及ぼせず、生存可能な細菌細胞を最小限の損傷でマイクロウェルから選択的に取り出し、そのDNAを下流ゲノム解析のために高純度で単離できることを示している。パーフルオロキル化カバースリップを取り除く前に、ヒドロゲルが形成されていることを常に確認してください。
ヒドロゲル蒸着用スペーサーを配置し、細胞の抽出用チューブを使用する場合は、精度と注意が必要です。
