細胞治療への関心が高まる中、これらの細胞の機能を評価するための新しい方法が必要とされています。このプロトコルは神経の文脈にこれらのセル移植の生体外の長期査定を可能にする。この手法の主な利点は、すべてのコンポーネントが人間の起源に由来することです。
また、生着を簡単に追跡でき、オルガノイドからの環境を簡単に変更できるため、さまざまな薬剤や治療法を試すことができます。このテクニックを実演するのは、私の研究室の優秀な博士課程の学生であるIliana Ibanezです。まず、人工多能性幹細胞またはiPS細胞由来神経前駆細胞(NPC)の単細胞懸濁液を氷から取り出し、300gで4°Cで5分間遠心分離します。
上清を除去し、細胞ペレットを3ミリグラム/ミリリットルの可溶化基底膜マトリックスに再懸濁して、注入あたり2マイクロリットルの最終容量を得ます。使用するまで、すぐにサスペンションを氷に戻します。冷やしたシリンジを摂氏20度の冷凍庫からアイスバケットに移し、さらに使用します。
次に、インキュベーターから脳オルガノイドプレートを取り出し、口径の広いチップを使用してオルガノイドを35mmのディッシュに移します。オルガノイドを安定させ、注入を容易にするために、オルガノイドを傷つけることなく培地を可能な限り除去します。オルガノイドが入った35mmの皿を解剖顕微鏡の下に置き、注入を容易にします。
オルガノイドを注入する準備ができたら、冷やしたP20ピペットチップを使用してEGFP標識NPC細胞を静かに再懸濁し、これらの細胞の2マイクロリットルを事前に冷却した滅菌スライドガラスに移します。氷からあらかじめ充填されたインスリン注射器を取り出し、針の斜角を下に向けて2マイクロリットルの細胞懸濁液をゆっくりと吸い上げます。オルガノイドが入った皿の蓋を開けてから、顕微鏡の焦点を合わせます。
片手で皿を持ち、針の斜角を上に置きます。そしてもう一方の手で、細胞をオルガノイド表面にゆっくりと注入します。細胞を注入した後、蓋を皿に戻し、注入したオルガノイドを1〜2分間インキュベートします。
次に、500マイクロリットルのオルガノイド培地をプレートに静かに添加してから、オルガノイドを先端径の広い24ウェルプレートに移します。オルガノイドを摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートし、2日ごとに培地を完全に交換します。非注入またはネガティブコントロールオルガノイドを蛍光顕微鏡にロードします。
また、自家蛍光を最小限に抑えるために、照明強度を1〜2、露光時間を80〜100ミリ秒に設定します。次に、ポジティブコントロールオルガノイドをロードし、曝露時間を増やして、標識細胞が見えるようにします。口径の広いピペットチップでオルガノイドを再配置し、注入用の増強された緑色蛍光タンパク質またはEGFP plus領域を見つけます。
オルガノイドを装填する前に、培地をオルガノイドから完全に除去します。そして、選択した設定で画像化します。イメージングが完了したら、オルガノイドが乾燥しないように、すぐに新しい培地を追加します。
すべてのオルガノイドについて培地の除去とイメージングを繰り返した後、オルガノイドを通常のインキュベーションと培地交換に戻します。希望の間隔でイメージングを繰り返します。トルエンを充填したCoplinスライド染色ジャーにスライドを2分間入れ、このステップを繰り返します。
次に、スライドガラスを100%エチルアルコールで満たされたガラス製のCoplinスライド染色ジャーに2分間移します。そして、この手順を繰り返してから、スライドを水で満たされたCoplinジャーに2分間移します。水洗いを繰り返します。
次に、プラスチック容器を水浴に入れ、プラスチックが浴槽の底に触れないようにします。プラスチック容器の中にクエン酸緩衝液を注ぎ、摂氏95〜100度にします。緩衝液が希望の温度に達したら、スライドを緩衝液の中に置き、容器を蓋でゆるく覆い、スライドをウォーターバス内に30〜40分間放置します。
インキュベーション後、プラスチック容器をウォーターバスから取り出し、室温で20分間冷まします。スライドをPBSでそれぞれ2分間、3回洗浄します。サンプルに触れずに紙ティッシュでPBSを取り除きます。
透過処理バッファーを調製し、スライドガラス染色ジャーに充填します。スライドを透過処理バッファーに浸し、10分間インキュベートします。PBSをそれぞれ2分間3回繰り返します。
次に、各サンプルを覆うように染色ミックスを調製し、オルガノイドスライドに25マイクロリットルを加えてから、スライドを室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、PBSをそれぞれ2分間3回洗浄し、スライドガラス染色ジャー内の蒸留水でスライドをすすぎ、塩を除去します。次に、蛍光顕微鏡を使用してスライドをイメージングする前に、各サンプルに10マイクロリットルの液体マウントとDAPIを追加します。
2Xクエンチングバッファーを半分まで充填したガラス製のCoplin染色ジャーに、45ミリリットルのPBSを加え、スライドをこのジャーに入れます。瓶を摂氏4度で一晩インキュベートします。蛍光顕微鏡を使用して、染色とイメージングを繰り返す前に、蛍光色素が効果的に消光されているかどうかを確認します。
GFP蛍光の明確な用量依存性は、10, 000細胞以上で一貫したEGFPと細胞パッチ検出で、入力細胞数に存在した。EGFP陽性の画像を画像化した注入オルガノイドとコントロールは、4か月の追跡期間を通じて注入部位の持続性を示しました。追加のEGFP陽性細胞パッチは、移植後9日で出現し、研究エンドポイントまで持続し、細胞の移動と新しい部位への統合を示しました。
より高い倍率では、オルガノイドへの長い突起で明確な神経形態が観察され、注入された細胞の統合が確認されました。最初の1回ラウンド染色では、NPC状態を保持する細胞と神経運命に向かって分化した細胞の混合物を含む、注射部位にEGFPプラス細胞が存在することが確認されました。対照オルガノイドと注入オルガノイドでは、Nestin plus NPCはごくわずかしか観察されず、TUJ1と未熟な成熟ニューロンが大半を占めました。
2つの円形染色により、より詳細が明らかになり、オルガノイドの外側の領域の大部分の周囲に成熟したニューロンがあり、中央に向かって未熟なニューロンの領域が明らかになりました。アストロサイトは、注入されたオルガノイドとコントロールオルガノイドに存在し、外縁の周囲に散在していました。注入したオルガノイドで2つの円形染色を行ったスライスは、成熟ニューロンの表現型を採用したEGFPプラス細胞の小さなサテライトコロニーを注入部位から遠く離れたところに示しました。
これらのコロニーのいくつかは、アストロサイトの近くにあるようです。しかし、GFP染色と完全に重複するEGFPプラス細胞は、アストロサイト自体を生成するのではなく、隣接していることを示唆していませんでした。オルガノイドを注入するときは、オルガノイドを完全に破壊する可能性があるため、力を入れすぎたり、速すぎたりしないようにする必要があります。
そのため、ライフトラッキング後、オルガノイドを関連付けて、フローサイトメトリー解析やシングルセルシーケンシングアプローチに使用することができます。これにより、細胞の分子状態を知ることができます。この技術は、神経変性疾患の細胞治療の進歩や、脳腫瘍や転移のモデル化に非常に役立つ可能性があります。
