この方法により、免疫シナプスでB細胞が適用する力の空間的時間分布を測定し、特定のタンパク質のリクルートと相関させることができる。ポリアクリルアミドゲルを用いた牽引力顕微鏡は実装が容易である。このプロトコルは、多数のB細胞の機械的能力の測定を迅速に設定するために使用できます。
この方法は柔軟であり、インテグリンのような他のリガンドをグラフ化したり、T細胞やフラステキ細胞症のような他の種類の免疫シナプスを研究するように適応することができる。この実験で必要とされるゲルの物理的および化学的性質のために、古典的な牽引力顕微鏡法をB細胞に適応させるのは難しいかもしれません。まず、ゲル支持体をサリン化します。
カバースリップまたはガラス底のペトリ皿をUVランプで2分間アクティブにし、200マイクロリットルのAPTMSで5分間塩分します。これにより、ゲルの共有結合に対する支持体を準備する。カバースリップまたはガラス底皿を超純水で十分に洗い、真空吸引を使用して乾燥させます。
ゲルを平らにするためのカバーリップを準備するには、セラミックカバースリップホルダーに入れ、ホルダーを小さなビーカーに入れ、カバーリップの上にシリコン化試薬を注ぎ、それらを完全に覆うことを確認します。ビーカーをアルミホイルで覆い、室温で3分間放置します。一方、超純水で大きなビーカーを充填します。
シリコン化試薬で3分間のインキュベーションの後、カバースリップホルダーをカバースリップでビーカーに水で移します。カバーリップを超純水で十分に洗い流します。よく乾かして紙の拭き取りに置きます。
最良の結果を得るには、すぐにゲル重合を進めます。原稿の指示に従って500パスカルゲルプレミックスを準備し、プレミックスの167マイクロリットルを1.67マイクロリットルのビーズと組み合わせます。5分間のバス超音波処理器で混合物を超音波処理します。
アルミニウムホイルで光からミックスを保護します。重合を生かすために、1.67マイクロリットルの10%過硫酸アンモニウムをゲルミックスに加え、0.2マイクロリットルのTEMEDを加え、ピペットで混合して重合を開始します。ゲルをキャストするには、9マイクロリットルのゲルを各塩分化カバースリップまたはガラス底皿にピペットします。
すぐにシリコン化カバースリップでゲルを平らにし、鉗子で押し下げて、ゲルがカバースリップの全領域に広がり、その一部が漏れるようにします。カバースリップまたはガラス底皿を大きなペトリ皿に反転させ、ベンチでタップしてビーズをゲル表面に向かって押し付けます。湿ったチャンバーを作成するために皿の上に加湿したティッシュを置きます。
アルミホイルで覆い、1時間インキュベートします。インキュベーション後、PBSをサンプルに添加してカバースリップ放出を容易にする。慎重に針でカバースリップを取り外し、皿をわずかに傾けますが、ゲルがPBSに沈んでいるようにします。
シリコーン化剤としては、アクリルアミド、塩基アクリルアミド、およびTEMEDが吸入により毒性を持つことができる。標準的な個人用保護具を着用し、化学フードの下でこれらの製品を操作します。ゲルからPBSを吸引し、室温でスルフォ-SANPAHの150マイクロリットルを加えます。
ゲルをUV処理に2分間曝し、その後PBSで3回洗浄します。スルフォ-SANPAHとPBSを使用して処理を繰り返し、250マイクロリットルの鶏卵リソチームまたはHELをゲルに加え、アルミニウム箔で覆われた摂氏4度の湿度室で一晩インキュベートします。インキュベーション後、HEL抗原を除去し、PBSでゲルを3回洗浄します。
最後に、500マイクロリットルのB細胞培養培地でゲルを覆い、室温にしておきます。画像処理には、熱および二酸化炭素制御を備えた共焦点顕微鏡を使用してください。ゲルから培地を吸引し、約200マイクロリットルを残す。
ゲルを顕微鏡に置きます。ビーズの2つの主要な層は、ゲルの底部と上部に表示されます。ゲル平面に焦点を当て、画像に等しい領域を見つけます。
イメージングエリアを慎重に選択し、焦点を合わせるようにしてください。適切なビーズ密度と均一な表面は、堅牢で信頼性の高い力の測定を得るための鍵です。MD4マウスから80マイクロリットルの原発Bリンパ球をゲルに加え、焦点を維持するためにゲルに触れるのを避ける。
フォーカスが正しく、セルがエリア内で下降して表示されることを確認します。細胞がゲルに到達する前に取得を開始します。イメージのスタックとしてムービーを開く、マクロの cropandsave.ijm を実行します。
出力ディレクトリを選択し、属性チャネル設定を構成します。長方形ツールで対象領域を選択し、T キーを使用して ROI リストに追加します。完了したら、[OK] をクリックします。マクロがセルのマスクを提案する場合は、それが十分であれば OK をクリックします。
問題がなければ、[OK] をクリックし、任意の選択ツールで閉じた領域を手動で選択し、[続行] をクリックします。MATLAB を開き、tfmv1.mを実行します。必要なパラメータを入力します。
具体的には、取得のピクセルサイズや時間間隔などの画像特性やヤングモジュラスEやポアソン比などのゲル特性を確認します。終了したら、元のファイルと同じディレクトリにソフトウェアの出力を見つけます。正しいビーズ画像は、星空に似た明るいスポットの均一でランダムな分布のように見えます。
ビーズの数が少なすぎる場合や、画像が焦点を合わせない場合、データと分析は信頼できません。細胞と基板の最初の接触の前に付いた基準フレームを用いて、ビーズの動きを目で観察することができる。概算結果は、単一の粒子追跡から得ることができる。
解析では、参照イメージ内のビーズがコントロールとしてセグメンテーションされます。ソフトウェアを用いて、各画素および各時点における局所応力のベクトルである変位および応力場を得ることができる。セルの面積に集積された変位および力場のスカラー製品は、基板上のセルによって発揮される総作業を提供する。
2つの生物学的条件を比較する場合、エネルギーが高原に到達した最後の時間ポイントにわたる平均曲線または平均値を計算することができる。力の空間的情報が関連する場合、各条件の単一の時点を比較することも可能である。蛍光抗原抽出時間経過の一例をここに示す。
シナプスでの蛍光シグナルの進行性の出現は、ゲルからの抗原剥離を示す。蛍光データは、平均抽出曲線を構築するために使用することができる。プロトコルの最もデリケートなステップは、カバースリップの下のゲルの重合です。
このステップは、比較的迅速かつ慎重に行う必要があり、ゲルがカバースリップの下で均一に絞られるようにする必要があります。この手順に従って、Bリンパ球を発現する蛍光タンパク質を使用して、細胞内構造の局在化と力のパターニングを同時に評価することができる。この技術は、遺伝的または化学的摂動と組み合わせて、細胞の収縮性および抗原取り込みにおける特定のタンパク質の役割を評価することができる。
