私たちのプロトコルは、マイクロ秒以内に分子の振動スペクトルの測定を可能にする刺激ラマン散乱顕微鏡を構築する方法を説明しています。また、イメージングに適用すると、ラベルフリーで非侵襲的な方法で物質の化学成分を局在化および定量するためのハイパースペクトル顕微鏡を提供することができます。このプロトコルには、主に生物学的および生物医学的な分野でいくつかの用途があります。
例えば、細胞、または組織を画像化する。私たちのアプローチには、ブロードバンド光源と検出チェーンという2つの重要な課題があります。前者に対処するには、OPRを購入するか、自分で構築することができます。
あるいは、バルク結晶または非線形光ファイバで生成された白色光超連続体を使用することができる。後者の課題は、市販のフォトダイオードおよびガルボスキャナで各スペクトル成分を順次走査することによって対処することができる まず、ポリメチルメタクリレートまたはPMMAマイクロビーズの水性懸濁液から2マイクロリットルを抽出し、懸濁液を顕微鏡カバースリップに注ぐ。次に、ポリスチレンマイクロビーズの水性懸濁液から2マイクロリットルを抽出し、それをカバースリップ上のPMMA懸濁液と組み合わせる。
懸濁液をピペットチップと軽く混合し、24時間乾燥させます。水が乾くと、カバースリップの上にビーズの白い層が表示されます。カバースリップの上に20マイクロリットルのジメチルスルホキシドと20マイクロリットルの純粋なオリーブオイルを加える。
そして、2番目の顕微鏡カバースリップの端にマニキュアを塗ります。マニキュアを下に向けてカバースリップを混合物の上に置き、それを密封するのに十分な圧力をかけます。乾かしましょう。
狭帯域ストークスビームの変調効率を最適化する。レンズF1とF2の距離を変更し、フォトダイオードで変調ビームを測定します。次に、そのプロファイルをオシロスコープで記録します。
得られた広帯域ポンプスペクトルが、1040ナノメートルの狭帯域ストークスとともに、2,800〜3,100逆センチメートル以内の周波数デチューニングを生成することができるように、光パラメトリック発振器のキャビティ長を調整する。このスペクトル範囲は、CH伸張領域の振動をカバーする。広帯域ポンプをプリズムコンプレッサーに送り、励起顕微鏡の対物レンズに含まれる分散効果を補償します。
ポンプをプリズムAの頂点から入力し、分散したポンプをプリズムBの頂点に導きます。必要な負の分散量を定義し、それに応じてプリズムの頂点間の距離を設定します。ブリュースターカットプリズムを使用し、ポンプビームの偏光がプリズムの三角形の平面内にあることを確認します。インライン平衡検出方式を最適化するには、この複屈折水晶の進相軸を垂直に設定し、分極ポンプを長さ13.3ミリメートルのYV04プレートに導きます。
次に、1/2波長板を使用してポンプビームの偏光を45度に設定します。ポンプとストークスビームをダイクロイックミラーと組み合わせて、一対の蛍光ピンホールで慎重に整列させます。両方のビームが直線的に伝搬していることを確認します。
ビームを減衰させ、高速フォトダイオードに導き、一時的に重なり合います。その後、フォトダイオードを外します。次に、校正されたカメラでビームプロファイルを測定し、赤外線カードを使用して目で直径を推定します。
2つの望遠鏡を使用してください。1つはポンプ用、もう1つはストークスビーム用で、ビーム直径を励起対物レンズの背面開口部に合わせるようにします。刺激されたラマン散乱(SRS信号)が得られたら、ポンプビームの望遠鏡を使用して直径を微調整し、レイリー範囲を変化させ、その結果、顕微鏡の焦点での相互作用体積を変化させます。
最大SRSに達したら停止します。フォトダイオードを使用してポンプビームの強度を測定し、フォトダイオードの応答性を使用して、検出器のアクティブ領域に衝突する平均電力を計算します。レーザの相対強度ノイズを測定するには、ローパスフィルタを取り外し、高帯域幅フォトダイオードの出力をロックインアンプの入力に接続します。
ロックイン出力をヘルツの平方根を超えるボルト単位でさまざまな復調周波数で保存し、フォトダイオードの応答性を使用してボルトをワットに変換します。ポンプとストークスビームを顕微鏡に導きます。サンプルを配置し、ビーズのない領域を見つけて、ポンプビームの位置合わせに役立てます。
次に、励起と収集の目的を混同します。ショートパスフィルターを入れて変調されたストークスを取り除き、ポンプビームをグレーディングに導きます。グレーディングの後にレンズを配置して、分散ビームを検出器に集束させます。
バランスの取れた検出のために、リファレンスのスペクトルとポンプビームに沿って伝播する信号レプリカを測定します。グレーディングと偏光ビームスプリッタの間に小さなスリットまたはアイリスを配置して、2つのフォトダイオードアレイ間のスペクトルマッチングを保証し、分散ポンプを空間的にフィルタリングします。ポンプレプリカの1つを除くすべてのスペクトル成分をクリップして、透過光線を基準および信号フォトダイオードアレイのN番目の検出器に集中させます。
ステアリングミラーを使用して、異なる検出チャンネルの相関関係を調整します。SRS顕微鏡を開始するには:ストークスを変調し、サンプルをラスタースキャンし、ポンプスペクトル上の変調転送を対応するDCスペクトルとともに取得して、各ピクセルから正規化されたSRSスペクトルを取得します。行と列にサンプルのスキャン位置が含まれる 3 次元行列を生成します。
XY 平面に直交する各ベクトルに、SRS スペクトルを格納します。濃度とスペクトルプロファイルをプロットして、サンプルの化学成分の化学画像と特性スペクトルを取得します。代表画像は、このプロトコルで使用される光源の相対強度ノイズスペクトルを示す。
ここに示されているのは、SRS実験に最適なスペクトル領域です。この帯域内の任意の周波数でストークスビームを変調することで、SRS信号に対するレーザーノイズの影響が可能な限り最小限に抑えられることが保証されます。アンバランススペクトルおよびバランススペクトルの例示的なデータがここに示されている。
バランスの取れた検出の効果は、実験の最終結果に影響を与えます。すなわち、化学マップ。アンバランスとバランスの条件での合成画像をここに示します。
代表的な画像は、ハイパースペクトルSRSデータのケモメトリック分析を示す。サンプルの異なる化学成分の濃度マップとそれらの特徴的なSRSスペクトルの合成がここに示されています。このデータから、試料の異なる成分、例えば、オリーブオイル、DMSOポリスチレン、およびポリメチルメタクリレートを容易に同定することができる。
現在、当社の技術はCH振動ストレッチのみをプローブできます。しかし、光源を最適化することで、同じ検出チェーンにより、一度に複数のモードを検出するより有益な指紋領域を探索することができます。当社の検出チェーンは、広帯域SRSを診療所に統合するための道を開き、組織診断のための従来の組織病理学ワークフローを補完および強化する技術を導入します。
