우리의 프로토콜은 마이크로 초 내에 분자의 진동 스펙트럼을 측정 할 수있는 자극 된 라만 산란 현미경을 구축하는 방법을 설명합니다. 그리고 이미징에 적용될 때, 그것은 라벨이없고 비 침습적 인 방식으로 물질의 화학적 성분을 국소화하고 정량화하기 위해 하이퍼 스펙트럼 현미경을 제공 할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 주로 생물 및 생물 의학 과학에 여러 가지 응용 프로그램이 있습니다.
예를 들어, 세포 또는 조직을 이미지화한다. 우리의 접근 방식에는 광대역 광 소스와 탐지 체인이라는 두 가지 중요한 과제가 있습니다. 전자를 다루기 위해 OPR을 구입하거나 직접 만들 수 있습니다.
대안적으로, 벌크 결정 또는 비선형 광섬유에서 생성된 백색광 초연속체를 사용할 수 있다. 후자의 과제는 상용 광 다이오드 및 갈보 스캐너로 각 스펙트럼 성분을 순차적으로 스캔하여 해결할 수 있습니다 시작하기 위해 폴리 메틸 메타 크릴 레이트 또는 PMMA 마이크로 비드의 수성 현탁액에서 두 마이크로 리터를 추출하고 현탁액을 현미경 커버 슬립에 붓습니다. 그런 다음 폴리스티렌 마이크로비드의 수성 현탁액에서 두 마이크로리터를 추출하고 커버 슬립의 PMMA 현탁액과 결합합니다.
현탁액을 피펫 팁과 부드럽게 혼합하고 24 시간 동안 건조시킵니다. 물이 마르면 덮개 슬립 위에 흰색 구슬 층이 나타납니다. 커버 슬립 위에 20 마이크로 리터의 디메틸 설폭사이드와 20 마이크로 리터의 순수한 올리브 오일을 넣으십시오.
그리고 두 번째 현미경 커버 슬립의 가장자리에 매니큐어를 바르십시오. 매니큐어가 아래를 향하도록 혼합물에 커버 슬립을 놓고 밀봉하기에 충분한 압력을 가하십시오. 그것을 말리십시오.
협대역 스토크스 빔의 변조 효율을 최적화한다. 렌즈 F1과 F2 사이의 거리를 변경하고 광 다이오드로 변조 빔을 측정합니다. 그런 다음 오실로스코프로 프로파일을 기록하십시오.
결과 광대역 펌프 스펙트럼이 1040 나노미터의 협대역 스토크와 함께 2, 800 ~ 3, 100 역 센티미터 내에서 주파수 디튜닝을 생성할 수 있도록 광학 파라메트릭 발진기의 캐비티 길이를 조정하십시오. 이 스펙트럼 범위는 CH 스트레칭 영역의 진동을 포함합니다. 광대역 펌프를 프리즘 압축기로 보내 여기 현미경 목표에 포함된 분산 효과를 보상합니다.
펌프를 정점을 통해 프리즘 A에 입력하고 분산 된 펌프를 프리즘 B의 정점쪽으로 안내하십시오.필요한 음의 분산량을 정의하고 그에 따라 프리즘 향신료 사이의 거리를 설정하십시오. 브루스터 컷 프리즘을 사용하고 펌프 빔의 편광이 프리즘의 삼각형 평면 내에 있는지 확인하십시오. 인라인 평형 검출 체계를 최적화하려면 이 복굴절성 크리스탈의 빠른 축을 수직으로 설정하고 편광 펌프를 길이 13.3mm의 YV04 플레이트로 안내합니다.
그런 다음 반파 플레이트를 사용하여 펌프 빔의 편광을 45도로 설정합니다. 펌프와 스토크스 빔을 이색성 거울과 결합하고 조심스럽게 한 쌍의 형광 핀홀과 정렬하십시오. 두 빔이 모두 선형으로 전파되고 있는지 확인하십시오.
빔을 감쇠시키고 빠른 광 다이오드로 안내하여 일시적으로 겹치게하십시오. 그런 다음 광 다이오드를 제거하십시오. 그런 다음 보정 된 카메라로 빔 프로파일을 측정하고 적외선 카드를 사용하여 눈으로 직경을 추정하십시오.
두 개의 망원경을 사용하십시오. 하나는 펌프용이고 다른 하나는 스토크스 빔용이며, 빔 직경을 여기 목표의 후면 조리개와 일치시키려고 합니다. 자극 된 라만 산란 또는 SRS 신호가 얻어지면 펌프 빔의 망원경을 사용하여 직경을 조정하여 레일리 범위를 변경하고 결과적으로 현미경의 초점에서 상호 작용 볼륨을 변경하십시오.
최대 SRS가 달성되면 중지하십시오. 광 다이오드를 사용하여 펌프 빔의 강도를 측정하고 광 다이오드의 응답성으로 검출기의 활성 영역에 충돌하는 평균 전력을 계산하십시오. 레이저의 상대 강도 잡음을 측정하려면 저역 통과 필터를 분리하고 고대역폭 광 다이오드의 출력을 잠금 증폭기의 입력에 연결하십시오.
잠금 출력을 서로 다른 복조 주파수에서 Hertz의 제곱근 이상의 볼트에 저장하고 포토 다이오드 응답성을 사용하여 볼트를 와트로 변환합니다. 펌프와 스토크스 빔을 현미경으로 안내하십시오. 샘플을 배치하고 펌프 빔을 정렬하는 데 도움이되는 구슬이없는 영역을 찾으십시오.
그런 다음 여기 및 수집 목표를 공초점으로 만듭니다. 단거리 통과 필터를 넣어 변조 된 스토크를 제거하고 펌프 빔을 그레이딩으로 안내하십시오. 그레이딩 후에 렌즈를 배치하여 분산된 빔을 검출기에 초점을 맞춥니다.
균형 잡힌 감지를 위해 기준의 스펙트럼과 펌프 빔을 따라 전파되는 신호 복제본을 측정하십시오. 그레이딩과 편광 빔 스플리터 사이에 작은 슬릿 또는 아이리스를 배치하여 두 광 다이오드 어레이 간의 스펙트럼 정합을 보장하고 분산된 펌프를 공간적으로 필터링합니다. 펌프 복제본의 스펙트럼 구성 요소 하나를 제외한 모든 스펙트럼 구성 요소를 클립하여 전송 된 광선을 참조 및 신호 광 다이오드 어레이의 N번째 검출기에 집중시킵니다.
스티어링 미러를 사용하여 다양한 감지 채널의 상관 관계를 조정합니다. SRS 현미경을 시작하려면:스톡스를 변조하고, 래스터를 스캔하고, 해당 DC 스펙트럼을 사용하여 펌프 스펙트럼에서 변조 전송을 획득하여 각 픽셀에서 정규화된 SRS 스펙트럼을 가져옵니다. 행과 열에 샘플의 스캔된 위치가 포함된 입체 행렬을 생성합니다.
XY 평면에 직교하는 각 벡터에 SRS 스펙트럼을 저장합니다. 농도 및 스펙트럼 프로파일을 플롯하여 샘플의 화학 구성 요소의 화학적 이미지 및 특성 스펙트럼을 획득합니다. 대표적인 이미지는 이 프로토콜에 사용된 광학 소스의 상대적 강도 잡음 스펙트럼을 보여준다.
여기에 표시된 것은 SRS 실험에 가장 적합한 스펙트럼 영역입니다. 이 대역 내의 모든 주파수에서 Stokes 빔을 변조하면 SRS 신호에 대한 레이저 잡음의 영향이 가능한 가장 낮을 수 있습니다. 불균형하고 균형 잡힌 스펙트럼의 예시적인 데이터가 여기에 도시되어 있다.
균형 잡힌 검출의 효과는 실험의 최종 결과에 영향을 미칩니다. 즉, 화학지도. 불균형하고 균형 잡힌 조건의 합성 이미지가 여기에 표시됩니다.
대표적인 이미지는 하이퍼스펙트럼 SRS 데이터의 화학학적 분석을 보여준다. 샘플의 상이한 화학적 구성성분의 농도 맵 및 이들의 특징적인 SRS 스펙트럼의 복합체가 여기에 도시되어 있다. 이러한 데이터로부터, 샘플의 상이한 구성성분, 예를 들어, 올리브 오일, DMSO 폴리스티렌, 및 폴리메틸 메타크릴레이트가 용이하게 확인될 수 있다.
현재, 우리의 기술은 CH 진동 스트레칭 만 조사 할 수 있습니다. 그러나 광학 소스를 최적화함으로써 동일한 감지 체인을 통해 한 번에 여러 모드를 감지하는보다 유익한 지문 영역을 탐색 할 수 있습니다. 우리의 검출 체인은 광대역 SRS를 클리닉에 통합하기위한 길을 열어 주며 조직 진단을위한 전통적인 조직 병리학 워크 플로우를 보완하고 향상시키는 기술을 도입합니다.
