Notre protocole décrit comment construire une microscopie à diffusion Raman stimulée, qui permet de mesurer le spectre vibratoire des molécules en quelques microsecondes. Et lorsqu’il est appliqué à l’imagerie, il peut fournir une microscopie hyperspectrale pour localiser et quantifier les constituants chimiques de la matière d’une manière non invasive et sans étiquette. Il existe plusieurs applications de ce protocole, principalement dans les sciences biologiques et biomédicales.
Par exemple, pour imager des cellules ou des tissus. Notre approche comporte deux défis importants : la source optique à large bande et la chaîne de détection. Pour répondre aux premiers, on peut acheter un OPR ou en construire un soi-même.
Alternativement, on peut utiliser le supercontinuum de lumière blanche généré dans des cristaux en vrac ou dans des fibres optiques non linéaires. Ce dernier défi peut être relevé en scannant séquentiellement chaque composant spectral avec une photodiode commerciale et un scanner galvo Pour commencer, extraire deux microlitres d’une suspension aqueuse de polyméthacrylate de méthyle, ou microbilles de PMMA, et verser la suspension sur un couvercle de microscope. Ensuite, extrayez deux microlitres d’une suspension aqueuse de microbilles de polystyrène et combinez-les avec la suspension en PMMA sur le couvercle.
Mélangez doucement la suspension avec une pointe de pipette et laissez-la sécher pendant 24 heures. Une couche blanche de perles apparaîtra sur le couvercle lorsque l’eau se dessèchera. Ajouter 20 microlitres de diméthylsulfoxyde et 20 microlitres d’huile d’olive pure sur le couvercle.
Et appliquez du vernis à ongles sur les bords du deuxième bordereau de couverture de microscope. Placez le couvercle sur le mélange, avec le vernis à ongles tourné vers le bas, et appliquez suffisamment de pression pour le sceller. Laissez sécher.
Optimiser l’efficacité de modulation du faisceau Stokes à bande étroite. Changez la distance entre les lentilles F1 et F2, et mesurez le faisceau modulé avec une photodiode. Ensuite, enregistrez son profil avec un oscilloscope.
Ajustez la longueur de la cavité de l’oscillateur paramétrique optique de manière à ce que le spectre de la pompe à large bande résultante, ainsi que le Stokes à bande étroite à 1040 nanomètres, puissent produire un désaccordage de fréquence dans les 2 800 à 3 100 centimètres inverses. Cette gamme spectrale couvre les vibrations de la région d’étirement CH. Envoyez la pompe à large bande à un compresseur à prisme pour compenser les effets de dispersion inclus par l’objectif du microscope d’excitation.
Entrez la pompe dans le prisme A, à travers son sommet, et guidez la pompe dispersée vers le sommet du prisme B.Définissez la quantité de dispersion négative nécessaire et définissez la distance entre les prismes apices en conséquence. Utilisez des prismes coupés Brewster et assurez-vous que la polarisation du faisceau de pompe se trouve dans les plans triangulaires des prismes. Pour optimiser le schéma de détection équilibré en ligne, réglez l’axe rapide de ce cristal biréfringent à la verticale et guidez la pompe polarisée vers une plaque YV04 d’une longueur de 13,3 millimètres.
Ensuite, utilisez une plaque demi-onde pour régler la polarisation du faisceau de la pompe à 45 degrés. Combinez la pompe et les faisceaux Stokes avec un miroir dichroïque et alignez-les soigneusement avec une paire de trous d’épingle fluorescents. Assurez-vous que les deux faisceaux se propagent de manière co-linéaire.
Atténuez les faisceaux et guidez-les sur une photodiode rapide pour les chevaucher temporairement. Après cela, retirez la photodiode. Ensuite, mesurez les profils de faisceau avec une caméra calibrée et utilisez une carte infrarouge pour estimer les diamètres à l’œil.
Utilisez deux télescopes. Un pour la pompe et un autre pour le faisceau de Stokes, et essayez de faire correspondre les diamètres du faisceau à l’ouverture arrière de l’objectif d’excitation. Une fois que la diffusion Raman stimulée, ou signal SRS, est obtenue, utilisez le télescope sur le faisceau de la pompe pour modifier son diamètre, en faisant varier sa portée de Rayleigh et, par conséquent, le volume d’interaction au foyer du microscope.
Arrêtez-vous lorsque le SRS maximal est atteint. Utilisez une photodiode pour mesurer l’intensité du faisceau de la pompe et, avec la réceptivité de la photodiode, calculez la puissance moyenne qui affecte la zone active du détecteur. Pour mesurer le bruit d’intensité relative du laser, déconnectez le filtre passe-bas et connectez la sortie d’une photodiode à large bande passante à l’entrée d’un amplificateur verrouillable.
Stockez la sortie de verrouillage en volts sur la racine carrée de Hertz à différentes fréquences de démodulation et utilisez la réceptivité des diodes photo pour convertir les volts en watts. Guidez la pompe et les faisceaux de Stokes vers le microscope. Placez l’échantillon et trouvez une région sans perles pour aider à aligner le faisceau de la pompe.
Ensuite, rendez les objectifs d’excitation et de collecte confocaux. Placez un filtre passe-court pour retirer les Stokes modulés et guidez le faisceau de la pompe vers le nivellement. Placez une lentille après le classement pour focaliser le faisceau dispersé sur les détecteurs.
Pour une détection équilibrée, mesurez le spectre de la référence et les répliques de signaux se propageant le long du faisceau de la pompe. Placez une petite fente, ou un iris, entre le graduage et un séparateur de faisceau polarisant, pour garantir la correspondance spectrale entre les deux réseaux de photodiodes et pour filtrer la pompe dispersée dans l’espace. Coupez tous les composants spectraux sauf un des répliques de pompe pour centrer les rayons transmis sur le nième détecteur des réseaux de photodiodes de référence et de signal.
Utilisez les rétroviseurs de direction pour ajuster la corrélation des différents canaux de détection. Pour démarrer la microscopie SRS: modulez les Stokes, scannez l’échantillon et acquérez le transfert de modulation sur le spectre de la pompe avec son spectre CC correspondant pour obtenir le spectre SRS normalisé de chaque pixel. Produire des matrices tridimensionnelles, dont les lignes et les colonnes contiennent les positions numérisées de l’échantillon.
Sur chaque vecteur orthogonal au plan XY, stockez un spectre SRS. Tracer la concentration et les profils spectraux pour acquérir les images chimiques et les spectres caractéristiques des constituants chimiques de l’échantillon. L’image représentative montre les spectres de bruit d’intensité relative des sources optiques utilisées dans ce protocole.
Voici la meilleure région spectrale pour les expériences SRS. La modulation du faisceau stokes à n’importe quelle fréquence de cette bande garantit que les effets du bruit laser sur le signal SRS seront les plus faibles possibles. Des données exemplaires des spectres déséquilibrés et équilibrés sont présentées ici.
Les effets d’une détection équilibrée ont un impact sur les résultats finaux des expériences. À savoir, les cartes chimiques. Les images composites dans des conditions déséquilibrées et équilibrées sont montrées ici.
Les images représentatives montrent une analyse chimiométrique des données hyperspectrales du SRS. Un composite des cartes de concentration des différents constituants chimiques de l’échantillon et de leurs spectres SRS caractéristiques est présenté ici. À partir de ces données, les différents constituants de l’échantillon, par exemple l’huile d’olive, le polystyrène DMSO et le polyméthacrylate de méthyle, peuvent être facilement identifiés.
Actuellement, notre technique ne peut sonder que l’étirement vibratoire CH. Cependant, en optimisant la source optique, la même chaîne de détection nous permettra d’explorer la région d’empreintes digitales plus informative détectant plusieurs modes à la fois. Notre chaîne de détection ouvre la voie à l’intégration du SRS à large bande dans les cliniques, en introduisant une technologie qui complétera et améliorera le flux de travail histopathologique traditionnel pour le diagnostic tissulaire.
