Protokolümüz, moleküllerin titreşim spektrumunun mikrosaniyeler içinde ölçülmesini sağlayan uyarılmış bir Raman Saçılma Mikroskobunun nasıl oluşturulacağını açıklar. Görüntülemeye uygulandığında, maddenin kimyasal bileşenlerini etiketsiz ve invaziv olmayan bir şekilde lokalize etmek ve ölçmek için hiperspektral mikroskopi sağlayabilir. Bu protokolün özellikle biyolojik ve biyomedikal bilimlerde çeşitli uygulamaları vardır.
Örneğin, hücreleri veya dokuları görüntülemek. Yaklaşımımızın iki önemli zorluğu vardır: geniş bant optik kaynağı ve algılama zinciri. İlkini ele almak için, bir OPR satın alabilir veya kendiniz bir tane inşa edebilirsiniz.
Alternatif olarak, dökme kristallerde veya doğrusal olmayan optik fiberlerde üretilen beyaz ışık süpersürekliliği kullanılabilir. İkinci zorluk, her spektral bileşeni ticari bir fotodiyot ve bir galvo tarayıcı ile sırayla tarayarak ele alınabilir Başlamak için, polimetil metakrilat veya PMMA mikroboncuklarının sulu bir süspansiyonundan iki mikrolitre çıkarın ve süspansiyonu bir mikroskop kapağı kaymasına dökün. Daha sonra, polistiren mikroboncukların sulu bir süspansiyonundan iki mikrolitre çıkarın ve kapak kayması üzerindeki PMMA süspansiyonu ile birleştirin.
Süspansiyonu bir pipet ucuyla yavaşça karıştırın ve 24 saat kurumaya bırakın. Su kuruduğunda kapak kaymasının üstünde beyaz bir boncuk tabakası görünecektir. Kapak kapağının üzerine 20 mikrolitre dimetil sülfoksit ve 20 mikrolitre saf zeytinyağı ekleyin.
Ve ikinci mikroskop kapağı kaymasının kenarlarına oje uygulayın. Kapak kaymasını, oje aşağı bakacak şekilde karışımın üzerine yerleştirin ve kapatmak için yeterli basınç uygulayın. Kurumasını bekleyin.
Dar bantlı Stokes ışınının modülasyon verimliliğini optimize etmek. F1 ve F2 lensleri arasındaki mesafeyi değiştirin ve modüle edilmiş ışını bir fotodiyot ile ölçün. Ardından, profilini bir osiloskop ile kaydedin.
Optik parametrik osilatörün boşluk uzunluğunu, elde edilen geniş bant pompa spektrumunun, 1040 nanometredeki dar bantlı Stokes ile birlikte, 2.800 ila 3.100 ters santimetre içinde bir frekans de-ayarı üretebileceği şekilde ayarlayın. Bu spektral aralık, CH germe bölgesinin titreşimlerini kapsar. Uyarma mikroskobu hedefinin içerdiği dağılım etkilerini telafi etmek için geniş bant pompasını bir prizma kompresörüne gönderin.
Pompayı tepe noktasından A prizmasına girin ve dağılmış pompayı prizma B'nin tepesine doğru yönlendirin.Gerekli negatif dağılım miktarını tanımlayın ve prizmalar apisleri arasındaki mesafeyi buna göre ayarlayın. Brewster kesilmiş prizmalar kullanın ve pompa kirişinin polarizasyonunun prizmaların üçgen düzlemlerinde bulunduğundan emin olun. Hat içi dengeli algılama şemasını optimize etmek için, bu çift kırılımlı kristal dikeyin hızlı eksenini ayarlayın ve polarize pompayı 13,3 milimetre uzunluğunda bir YV04 plakasına yönlendirin.
Ardından, pompa ışınının polarizasyonunu 45 dereceye ayarlamak için yarım dalga plakası kullanın. Pompayı ve Stokes kirişlerini dikroik bir ayna ile birleştirin ve bir çift floresan iğne deliği ile dikkatlice hizalayın. Her iki kirişin de eş doğrusal olarak yayıldığından emin olun.
Kirişleri zayıflatın ve geçici olarak üst üste binmeleri için hızlı bir fotodiyot üzerine yönlendirin. Bundan sonra, fotodiyotu çıkarın. Ardından, ışın profillerini kalibre edilmiş bir kamerayla ölçün ve çapları gözle tahmin etmek için kızılötesi kart kullanın.
İki teleskop kullanın. Biri pompa için, diğeri Stokes ışını için ve ışın çaplarını uyarma hedefinin arka açıklığına eşleştirmeye çalışın. Uyarılmış Raman saçılması veya SRS sinyali elde edildikten sonra, çapını, Rayleigh aralığını ve dolayısıyla mikroskopun odağındaki etkileşim hacmini değiştirmek için pompa ışını üzerindeki teleskopu kullanın.
Maksimum SRS elde edildiğinde durdurun. Pompa ışınının yoğunluğunu ölçmek için bir fotodiyot kullanın ve fotodiyotun sorumluluğuyla, dedektörün aktif alanına çarpan ortalama gücü hesaplayın. Lazerin göreceli yoğunluk gürültüsünü ölçmek için, düşük geçişli filtrenin bağlantısını kesin ve yüksek bant genişlikli bir fotodiyotun çıkışını kilitli bir amplifikatörün girişine bağlayın.
Kilitleme çıkışını farklı demodülasyon frekanslarında Hertz'in karekökü üzerinde volt cinsinden saklayın ve voltları Watt'a dönüştürmek için foto diyotların sorumluluğunu kullanın. Pompayı ve Stokes ışınlarını mikroskopa yönlendirin. Numuneyi yerleştirin ve pompa kirişini hizalamaya yardımcı olması için boncuksuz bir bölge bulun.
Ardından, uyarma ve toplama hedeflerini konfokal hale getirin. Modüle edilmiş Stokes'u çıkarmak için bir kısa geçiş filtresi takın ve pompa kirişini tesviyeye yönlendirin. Dağınık ışını dedektörlere odaklamak için derecelendirmeden sonra bir lens yerleştirin.
Dengeli algılama için, referansın spektrumunu ve pompa ışını boyunca yayılan sinyal kopyalarını ölçün. İki fotodiyot dizisi arasındaki spektral eşleşmeyi garanti etmek ve dağılmış pompayı mekansal olarak filtrelemek için derecelendirme ve polarize edici bir ışın ayırıcı arasına küçük bir yarık veya bir iris yerleştirin. İletilen ışınları referans ve sinyal fotodiyot dizilerinin Nth dedektörü üzerinde ortalamak için pompa kopyalarının bir spektral bileşeni hariç hepsini kırpın.
Farklı algılama kanallarının korelasyonunu ayarlamak için direksiyon aynalarını kullanın. SRS mikroskobunu başlatmak için: Stokes'u modüle edin, raster numuneyi tarar ve her pikselden normalleştirilmiş SRS spektrumunu elde etmek için karşılık gelen DC spektrumu ile pompa spektrumu üzerindeki modülasyon transferini elde edin. Satırları ve sütunları numunenin taranmış konumlarını içeren üç boyutlu matrisler üretin.
XY düzlemine ortogonal olan her vektörde, bir SRS spektrumu depolayın. Numunenin kimyasal bileşenlerinin kimyasal görüntülerini ve karakteristik spektrumlarını elde etmek için konsantrasyonu ve spektral profilleri çizin. Temsili görüntü, bu protokolde kullanılan optik kaynakların göreceli yoğunluk gürültü spektrumlarını göstermektedir.
Burada SRS deneyleri için en iyi spektral bölge gösterilmektedir. Stokes ışınını bu bant içindeki herhangi bir frekansta modüle etmek, lazer gürültüsünün SRS sinyali üzerindeki etkilerinin mümkün olan en düşük seviyede olacağını garanti eder. Dengesiz ve dengeli spektrumların örnek bir verisi burada gösterilmiştir.
Dengeli algılamanın etkileri, deneylerin nihai sonuçlarını etkiler. Yani, kimyasal haritalar. Dengesiz ve dengeli koşullardaki kompozit görüntüler burada gösterilmiştir.
Temsili görüntüler, hiperspektral SRS verilerinin kemometrik analizini göstermektedir. Numunenin farklı kimyasal bileşenlerinin konsantrasyon haritalarının ve karakteristik SRS spektrumlarının bir bileşimi burada gösterilmiştir. Bu verilerden, numunenin farklı bileşenleri, örneğin zeytinyağı, DMSO polistiren ve polimetil metakrilat kolayca tanımlanabilir.
Şu anda, tekniğimiz sadece CH titreşim germe işlemini araştırabilir. Bununla birlikte, optik kaynağı optimize ederek, aynı algılama zinciri, aynı anda birkaç modu algılayan daha bilgilendirici parmak izi bölgesini keşfetmemize izin verecektir. Tespit zincirimiz, geniş bant SRS'nin kliniklere entegrasyonunun yolunu açarak, doku teşhisi için geleneksel histopatoloji iş akışını tamamlayacak ve geliştirecek bir teknoloji sunar.
