Nuestro protocolo describe cómo construir una microscopía de dispersión Raman estimulada, que permite la medición del espectro vibratorio de las moléculas en microsegundos. Y cuando se aplica a las imágenes, puede proporcionar microscopía hiperespectral para localizar y cuantificar los componentes químicos de la materia de una manera libre de etiquetas y no invasiva. Existen varias aplicaciones de este protocolo, principalmente en las ciencias biológicas y biomédicas.
Por ejemplo, para obtener imágenes de células o tejidos. Hay dos desafíos importantes para nuestro enfoque, la fuente óptica de banda ancha y la cadena de detección. Para abordar lo primero, uno puede comprar un OPR o construir uno usted mismo.
Alternativamente, se puede usar el supercontinuo de luz blanca generado en cristales a granel o en fibras ópticas no lineales. Este último desafío se puede abordar escaneando secuencialmente cada componente espectral con un fotodiodo comercial y un escáner galvo Para comenzar, extraiga dos microlitros de una suspensión acuosa de metacrilato de polimetilo, o microperlas de PMMA, y vierta la suspensión en un deslizamiento de la cubierta del microscopio. Luego, extraiga dos microlitros de una suspensión acuosa de microperlas de poliestireno y combínela con la suspensión de PMMA en el resbalón de la cubierta.
Mezcle suavemente la suspensión con una punta de pipeta y déjela secar durante 24 horas. Una capa blanca de cuentas aparecerá en la parte superior del resbalón de la cubierta cuando el agua se seque. Agregue 20 microlitros de dimetilsulfóxido y 20 microlitros de aceite de oliva puro en la parte superior de la cubierta.
Y aplique esmalte de uñas en los bordes del segundo deslizamiento de la cubierta del microscopio. Coloque el resbalón de la cubierta sobre la mezcla, con el esmalte de uñas hacia abajo, y aplique suficiente presión para sellarlo. Déjalo secar.
Optimizar la eficiencia de modulación del haz Stokes de banda estrecha. Cambie la distancia entre las lentes F1 y F2, y mida el haz modulado con un fotodiodo. Luego, registre su perfil con un osciloscopio.
Ajuste la longitud de la cavidad del oscilador paramétrico óptico de tal manera que el espectro de la bomba de banda ancha resultante, junto con el Stokes de banda estrecha a 1040 nanómetros, pueda producir un desajuste de frecuencia dentro de 2, 800 a 3, 100 centímetros inversos. Este rango espectral cubre las vibraciones de la región de estiramiento CH. Envíe la bomba de banda ancha a un compresor de prisma para compensar los efectos de dispersión incluidos por el objetivo del microscopio de excitación.
Ingrese la bomba en el prisma A, a través de su ápice, y guíe la bomba dispersa hacia el ápice del prisma B.Defina la cantidad de dispersión negativa necesaria y establezca la distancia entre los ápices de los prismas en consecuencia. Use prismas de corte Brewster y asegúrese de que la polarización del haz de la bomba se encuentre dentro de los planos triangulares de los prismas. Para optimizar el esquema de detección equilibrada en línea, ajuste el eje rápido de esta vertical de cristal birrefringente y guíe la bomba polarizada a una placa YV04 con una longitud de 13,3 milímetros.
Luego, use una placa de media onda para ajustar la polarización del haz de la bomba a 45 grados. Combine la bomba y los haces Stokes con un espejo dicroico y alinee cuidadosamente con un par de agujeros fluorescentes. Asegúrese de que ambos haces se propagan coplinealmente.
Atenúa los haces y guíalos hacia un fotodiodo rápido para superponerlos temporalmente. Después de eso, retire el fotodiodo. A continuación, mida los perfiles del haz con una cámara calibrada y use una tarjeta infrarroja para estimar los diámetros a simple vista.
Usa dos telescopios. Uno para la bomba y otro para el haz stokes, y trate de hacer coincidir los diámetros del haz con la apertura posterior del objetivo de excitación. Una vez que se obtiene la dispersión Raman estimulada, o señal SRS, use el telescopio en el haz de la bomba para ajustar su diámetro, variando su rango de Rayleigh y, en consecuencia, el volumen de interacción en el foco del microscopio.
Deténgase cuando se alcance el SRS máximo. Utilice un fotodiodo para medir la intensidad del haz de la bomba y, con la responsabilidad del fotodiodo, calcule la potencia media que incide en el área activa del detector. Para medir el ruido de intensidad relativa del láser, desconecte el filtro de paso bajo y conecte la salida de un fotodiodo de alto ancho de banda a la entrada de un amplificador de bloqueo.
Almacene la salida de bloqueo en voltios sobre la raíz cuadrada de Hertz a diferentes frecuencias de demodulación y use la responsividad de los fotodiodos para convertir voltios a vatios. Guíe la bomba y los haces de Stokes al microscopio. Coloque la muestra y encuentre una región sin perlas para ayudar a alinear el haz de la bomba.
Luego, haz que los objetivos de excitación y recolección sean confocales. Coloque un filtro de paso corto para quitar los Stokes modulados y guíe el haz de la bomba hasta la nivelación. Coloque una lente después de la clasificación para enfocar el haz disperso en los detectores.
Para una detección equilibrada, mida el espectro de la referencia y las réplicas de señal que se propagan a lo largo del haz de la bomba. Coloque una pequeña hendidura, o un iris, entre la gradación y un divisor de haz polarizador, para garantizar la coincidencia espectral entre las dos matrices de fotodiodos y para filtrar espacialmente la bomba dispersa. Recorte todos los componentes espectrales de las réplicas de la bomba excepto uno para centrar los rayos transmitidos en el detector N-ésimo de las matrices de fotodiodos de referencia y señal.
Utilice los espejos de dirección para ajustar la correlación de los diferentes canales de detección. Para iniciar la microscopía SRS: modular el Stokes, escanear la muestra y adquirir la transferencia de modulación en el espectro de la bomba con su correspondiente espectro dc para obtener el espectro SRS normalizado de cada píxel. Producir matrices tridimensionales, cuyas filas y columnas contienen las posiciones escaneadas de la muestra.
En cada vector ortogonal al plano XY, almacene un espectro SRS. Trazar la concentración y los perfiles espectrales para adquirir las imágenes químicas y los espectros característicos de los constituyentes químicos de la muestra. La imagen representativa muestra los espectros de ruido de intensidad relativa de las fuentes ópticas utilizadas en este protocolo.
Aquí se muestra la mejor región espectral para los experimentos SRS. La modulación del haz de Stokes a cualquier frecuencia dentro de esta banda garantiza que los efectos del ruido láser en la señal SRS serán los más bajos posibles. Aquí se muestran datos ejemplares de los espectros desequilibrados y equilibrados.
Los efectos de la detección equilibrada afectan los resultados finales de los experimentos. A saber, los mapas químicos. Las imágenes compuestas en las condiciones desequilibradas y equilibradas se muestran aquí.
Las imágenes representativas muestran un análisis quimiométrico de los datos hiperespectrales de SRS. Aquí se muestra un compuesto de los mapas de concentración de los diferentes componentes químicos de la muestra y sus espectros SRS característicos. A partir de estos datos, se pueden identificar fácilmente los diferentes componentes de la muestra, por ejemplo, aceite de oliva, poliestireno DMSO y metacrilato de polimetilo.
Actualmente, nuestra técnica solo puede sondear el estiramiento de vibración CH. Sin embargo, al optimizar la fuente óptica, la misma cadena de detección nos permitirá explorar la región de huellas dactilares más informativa detectando varios modos a la vez. Nuestra cadena de detección allana el camino para la integración de SRS de banda ancha en las clínicas, introduciendo una tecnología que complementará y mejorará el flujo de trabajo tradicional de histopatología para el diagnóstico de tejidos.
