Nosso protocolo descreve como construir uma estimulada Microscopia de Dispersão raman, que permite a medição do espectro vibracional das moléculas dentro de microssegundos. E quando aplicado à imagem, pode fornecer microscopia hiperespectral para localizar e quantificar os componentes químicos da matéria de forma livre de rótulos e não invasivas. Existem várias aplicações desse protocolo, principalmente nas ciências biológicas e biomédicas.
Por exemplo, para células de imagem, ou tecidos. Há dois desafios importantes para nossa abordagem, a fonte óptica de banda larga e a cadeia de detecção. Para abordar o primeiro, pode-se comprar um OPR ou construir um você mesmo.
Alternativamente, pode-se usar o supercontinuo de luz branca gerado em cristais a granel ou em fibras ópticas não lineares. Este último desafio pode ser resolvido escaneando seqüentemente cada componente espectral com um fotodiodo comercial e um scanner galvo Para começar, extrair dois microlitros de uma suspensão aquosa de metacrilato de polimetila, ou microesferas PMMA, e despeje a suspensão em um deslizamento de tampa de microscópio. Em seguida, extraia dois microlitadores de uma suspensão aquosa de microesferas de poliestireno e combine-o com a suspensão pmma no deslizamento de tampa.
Misture delicadamente a suspensão com uma ponta de pipeta e deixe secar por 24 horas. Uma camada branca de contas aparecerá em cima do deslizamento da tampa quando a água se desligar. Adicione 20 microliters de sulfóxido de dimetila e 20 microliters de azeite puro em cima do deslizamento de cobertura.
E aplique esmalte nas bordas do segundo deslizamento de tampa do microscópio. Coloque o deslizamento da tampa sobre a mistura, com o esmalte voltado para baixo, e aplique pressão suficiente para selá-la. Deixe secar.
Para otimizar a eficiência de modulação do feixe stokes de banda estreita. Altere a distância entre as lentes F1 e F2, e meça o feixe modulado com um fotodiodo. Então, regissou seu perfil com um osciloscópio.
Ajuste o comprimento da cavidade do oscilador óptico paramétrico de tal forma que o espectro de bomba de banda larga resultante, juntamente com o Stokes de banda estreita a 1040 nanômetros, pode produzir uma desafinação de frequência dentro de 2.800 a 3.100 centímetros inversos. Esta faixa espectral cobre as vibrações da região de alongamento do CH. Envie a bomba de banda larga para um compressor prisma para compensar os efeitos de dispersão incluídos pelo objetivo do microscópio de excitação.
Digite a bomba em prisma A, através de seu ápice, e guie a bomba dispersa em direção ao ápice do prisma B.Defina a quantidade de dispersão negativa necessária e ajuste a distância entre os prismas em conformidade. Use prismas cortados brewster, e certifique-se de que a polarização do feixe da bomba está dentro dos planos triangulares dos prismas. Para otimizar o esquema de detecção em linha balanceada, defina o eixo rápido desta vertical de cristal de birefringent e guie a bomba polarizada para uma placa YV04 com um comprimento de 13,3 milímetros.
Em seguida, use uma placa de meia onda para definir a polarização do feixe da bomba para 45 graus. Combine a bomba e os feixes de Stokes com um espelhodicróico e alinhe-os cuidadosamente com um par de pinros fluorescentes. Certifique-se de que ambos os feixes estão se propagando co-linearmente.
Atenuar as vigas e guiá-las para um fotodiodo rápido para sobrepor temporariamente. Depois disso, remova o fotodiodo. Em seguida, meça os perfis do feixe com uma câmera calibrada e use uma placa infravermelha para estimar os diâmetros por olho.
Use dois telescópios. Um para a bomba e outro para o feixe de Stokes, e tente combinar os diâmetros do feixe com a abertura traseira do objetivo de excitação. Uma vez que a dispersão de Raman estimulada, ou sinal SRS, é obtida, use o telescópio no feixe da bomba para ajustar seu diâmetro, variando sua faixa de Rayleigh e, consequentemente, o volume de interação no foco do microscópio.
Pare quando o SRS máximo for alcançado. Use um fotodiodo para medir a intensidade do feixe da bomba, e com a responsabilidade do fotodiodo, calcule a potência média que afeta a área ativa do detector. Para medir o ruído de intensidade relativa do laser, desconecte o filtro de baixa passagem e conecte a saída de um fotodiodo de alta largura de banda à entrada de um amplificador de travamento.
Armazene a saída de lock-in em volts sobre a raiz quadrada de Hertz em diferentes frequências de desmodulação e use a responsabilidade de diodos fotográficos para converter volts em Watts. Guie a bomba e os feixes de Stokes até o microscópio. Coloque a amostra e encontre uma região sem contas para ajudar a alinhar o feixe da bomba.
Em seguida, faça confocal os objetivos de excitação e coleta. Coloque um filtro de curto-tempo para remover os Stokes modulados e guie o feixe da bomba até a classificação. Coloque uma lente após a classificação para concentrar o feixe disperso nos detectores.
Para detecção equilibrada, meça o espectro da referência e as réplicas de sinal que se propagam ao longo do feixe da bomba. Coloque uma pequena fenda, ou uma íris, entre a classificação e um divisor de feixe polarizador, para garantir a correspondência espectral entre as duas matrizes de fotodiodo e filtrar a bomba dispersa espacialmente. Clipe todos, exceto um componente espectral das réplicas da bomba para centralizar os raios transmitidos no detector Nth das matrizes de referência e fotodiodo de sinal.
Use os espelhos de direção para ajustar a correlação dos diferentes canais de detecção. Para iniciar a microscopia SRS:modular os Stokes, escaneie a amostra e adquira a transferência de modulação no espectro da bomba com seu espectro DC correspondente para obter o espectro SRS normalizado de cada pixel. Produzir matrizes tridimensionais, cujas linhas e colunas contêm as posições digitalizadas da amostra.
Em cada ortogonal vetorial para o plano XY, armazene um espectro SRS. Traçar a concentração e os perfis espectrais para adquirir as imagens químicas e os espectros característicos dos componentes químicos da amostra. A imagem representativa mostra o espectro de ruído de intensidade relativa das fontes ópticas utilizadas neste protocolo.
Mostrada aqui é a melhor região espectral para os experimentos srs. Modular o feixe de Stokes em qualquer frequência dentro desta banda garante que os efeitos do ruído laser no sinal SRS serão os mais baixos possíveis. Um dado exemplar dos espectros desequilibrados e equilibrados são mostrados aqui.
Os efeitos da detecção equilibrada impactam os resultados finais dos experimentos. Ou seja, os mapas químicos. As imagens compostas nas condições desequilibradas e equilibradas são mostradas aqui.
As imagens representativas mostram uma análise quimiotítrica dos dados hiperespectrais da SRS. Um composto dos mapas de concentração dos diferentes componentes químicos da amostra e seus espectros característicos de SRS são mostrados aqui. A partir desses dados, os diferentes constituintes da amostra, por exemplo, azeite de oliva, poliestireno DMSO e metacrilato de polimetilo podem ser facilmente identificados.
Atualmente, nossa técnica só pode sondar o alongamento de vibração CH. No entanto, ao otimizar a fonte óptica, a mesma cadeia de detecção nos permitirá explorar a região de impressão digital mais informativa detectando vários modos ao mesmo tempo. Nossa cadeia de detecção abre caminho para a integração da SRS banda larga nas clínicas, introduzindo uma tecnologia que complementará e melhorará o fluxo de trabalho tradicional da histopatologia para o diagnóstico tecidual.
