基于宽带受激拉曼散射显微镜的多重化学成像

我们的实验方案描述了如何构建受激拉曼散射显微镜，该显微镜能够在微秒内测量分子的振动光谱。当应用于成像时，它可以提供高光谱显微镜，以无标记和非侵入性的方式定位和量化物质的化学成分。该协议有几种应用，主要在生物和生物医学科学中。

例如，对细胞或组织进行成像。我们的方法面临两个重要挑战，即宽带光源和检测链。为了解决前者，可以购买OPR或自己构建一个。

或者，可以使用在块状晶体或非线性光纤中产生的白光超连续体。后一个挑战可以通过用商用光电二极管和振镜扫描仪按顺序扫描每个光谱组分来解决 首先，从聚甲基丙烯酸甲酯或PMMA微珠的水悬浮液中提取两微升，然后将悬浮液倒在显微镜盖玻片上。然后，从聚苯乙烯微珠的水悬浮液中提取两微升，并将其与盖玻片上的PMMA悬浮液结合。

用移液器吸头轻轻混合悬浮液，使其干燥24小时。当水变干时，盖玻片的顶部会出现一层白色的珠子。在盖玻片顶部加入20微升二甲基亚砜和20微升纯橄榄油。

并在第二个显微镜盖玻片的边缘涂上指甲油。将盖玻片放在混合物上，指甲油朝下，并施加足够的压力将其密封。让它干燥。

优化窄带斯托克斯光束的调制效率。更改镜头F1和F2之间的距离，并使用光电二极管测量调制光束。然后，用示波器记录其轮廓。

调整光学参数振荡器的腔体长度，使得产生的宽带泵浦频谱与1040纳米的窄带斯托克斯一起，可以在2， 800至3， 100反厘米内产生频率去调谐。该光谱范围涵盖了CH拉伸区域的振动。将宽带泵送至棱镜压缩机，以补偿激发显微镜物镜所包含的色散效应。

将泵通过其顶点进入棱镜A，并将分散的泵引向棱镜B的顶点，定义所需的负色散量并相应地设置棱镜尖之间的距离。使用布鲁斯特切割棱镜，并确保泵梁的极化位于棱镜的三角形平面内。要优化在线平衡检测方案，请将该双折射晶体垂直的快速轴设置为快轴，并将极化泵引导至长度为13.3毫米的YV04板。

然后，使用半波片将泵束的极化设置为45度。将泵和斯托克斯光束与二向色镜相结合，并小心地将它们与一对荧光针孔对齐。确保两个波束共线性传播。

衰减光束并将其引导到快速光电二极管上以暂时重叠它们。之后，取下光电二极管。接下来，使用经过校准的相机测量光束轮廓，并使用红外卡通过眼睛估计直径。

使用两个望远镜。一个用于泵，另一个用于斯托克斯光束，并尝试将光束直径与激励物镜的后孔径相匹配。一旦获得受激的拉曼散射或SRS信号，使用泵浦光束上的望远镜调整其直径，改变其瑞利范围，从而改变显微镜焦点处的相互作用体积。

达到最大 SRS 时停止。使用光电二极管测量泵浦光束的强度，并利用光电二极管的响应度计算撞击探测器有效面积的平均功率。要测量激光器的相对强度噪声，请断开低通滤波器，并将高带宽光电二极管的输出连接到锁相放大器的输入端。

在不同的解调频率下，以伏特为单位存储锁相输出，超过赫兹的平方根，并使用光电二极管响应将伏特转换为瓦特。将泵和斯托克斯光束引导至显微镜。放置样品并找到一个没有珠子的区域，以帮助对齐泵束。

然后，使激发和收集目标共聚焦。放置一个短通滤波器以去除调制的斯托克斯，并将泵束引导至分级。在分级后放置透镜，将分散的光束聚焦到探测器上。

对于平衡检测，测量参考的频谱和沿泵束传播的信号副本。在分级和偏振分束器之间放置一个小狭缝或光圈，以确保两个光电二极管阵列之间的光谱匹配，并在空间上滤波分散的泵。夹住泵浦复制品除一个光谱分量之外的所有光谱分量，以将传输的光线集中在参考和信号光电二极管阵列的第N个探测器上。

使用转向镜调整不同检测通道的相关性。启动SRS显微镜:调制斯托克斯，对样品进行光栅扫描，并获取泵浦光谱上的调制传递及其相应的直流频谱，以获得来自每个像素的归一化SRS光谱。生成三维矩阵，其行和列包含样品的扫描位置。

在与 XY 平面正交的每个矢量上，存储一个 SRS 谱。绘制浓度和光谱图，以获得化学图像和样品化学成分的特征光谱。代表性图像显示了该协议中使用的光源的相对强度噪声光谱。

这里显示的是SRS实验的最佳光谱区域。在此频段内的任何频率调制斯托克斯光束，可以保证激光噪声对SRS信号的影响尽可能小。这里显示了不平衡和平衡光谱的示例性数据。

平衡检测的效果会影响实验的最终结果。即化学图。此处显示了不平衡和平衡条件下的合成图像。

代表性图像显示了高光谱SRS数据的化学计量分析。这里显示了样品不同化学成分的浓度图及其特征SRS光谱的复合图。从这些数据中，可以很容易地鉴定样品的不同成分，例如橄榄油，DMSO聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯。

目前，我们的技术只能探测CH振动拉伸。然而，通过优化光源，相同的检测链将使我们能够探索信息更丰富的指纹区域，同时检测几种模式。我们的检测链为宽带SRS整合到诊所铺平了道路，引入了一种技术，可以补充和增强传统的组织病理学工作流程，用于组织诊断。