この作品は、ウェルカムトラスト、医学研究評議会、王立協会、バーミンガムサイエンスシティと不妊の研究の信頼によって資金を供給される。我々は、イメージングのリグを構築し、統合にケーン研究の専門家の支援に感謝します。

通常の精液検査と健康肥沃な男性からの精子は、通常、次のように画像処理のために準備されています。 <ol><li>精液サンプルは最大30分間37℃で保存されています。 1.8のCaCl 2 · 2H 2 O、5.37のKCl、0.81のMgSO 4 · 7H 2 O、26.2 NaHCO 3を 、1.0のNaH 2 PO 4：mMの、細胞が補充アールの平衡塩溶液（sEBSSにスイムアップによって精漿から分離されています。 2H 2 O、0.3％木炭de-lipidated/fatty酸フリーフラクションV BSA（BSAの品質は、精子の正常な受精能獲得のために重要である）を添加した116.4のNaCl、55.6 D -グルコース、2.73のNaピルビン酸、41.8のNa乳酸）。 sEBBS 1 mlを5 mlのチューブのシリーズのそれぞれにピペットでゆっくりと精液の0.3 mlをunderlayeredている。 1時間のインキュベーションの後（37℃、6％CO 2）上位0.7ミリリットルを静かに各チューブから除去し、プールされます。精子懸濁液10μlを、細胞を固定するために1％ホルマリン（v / v）を90μlで希釈され、その後、精子がノイバウアーチャンバ内にカウントされます。懸濁液中の細胞密度は、6万細胞/ mlに（sEBSS付き）調整されます。 </li><li>受精能獲得を可能にするために5-6時間で、（6％CO 2 37 ° C）試料は、その後緩やかに覆われた管とインキュベーションで200μlのアリコートに分割されています。 </li><li>カバースリップ（22x50 mm）は、以前にポリ- D -リジンで処理されています。ポリ- D -リジン溶液（10％w / v）の10μlを、カバースリップの中央に小さな液滴の数として適用されます。ポリ- D -リジンは、空気乾燥されている。これは、加熱されたステージ上に置くことができますし、乾燥を完了するはずです。 、perfusable、専用、密閉ポリカーボネートイメージング室（寸法35ミリメートル× 20ミリメートル× 5ミリメートル、≈180μlの容量）に真空グリースでカバーに取り付けられている。ワーナーRC20チャンバーに似てポリ- D -リジンは、コー​​ティングされたカバースリップは、細胞を倒立顕微鏡上で表示されているチャンバーの基盤を形成し、12 mm径の円形カバースリップは、光の透過を可能に、チャンバーの上面を形成している。 </li><li>オレゴングリーンBAPTA1 - AM（OGB）またはカルシウムグリーン1 - AMは、ラベルのセルに使用されます。 OGBはDMSOに溶解して調製する。プルロン酸F127は、（洗剤）染料の&quot;凝集&quot;を防止するためにDMSOに含まれています。これは、使用直前に、液（0.5mlのDMSO中100 mgのプルロニック）実験室で調製する​​ことができる、または事前に用意された購入することができます。 20μlのOGBの50μgのアリコート（2.5 mg / mlの）に追加されます。バイアルは、凍結し、後で使用するために解凍保存することができます。 </li><li>精子の受精能獲得後（sEBBSで5〜6時間、37℃、6％CO 2）チューブは、イメージングのために選択され、OGBソリューション1.2μlを添加し、10μMの最終濃度を与える。チューブは、その後、細胞懸濁液を静かにP1000（青）ピペットの先端を持つイメージングチャンバーの流入口に注入された後、さらに40分間インキュベートする。チャンバーは20分間、ダウンインキュベーター、ポリ- D -リジンコートしたカバースリップの側に配置されます。細胞はチャンバーの表面に沿って泳ぐこととポリ- D -リジンでコーティングされた領域に付着する傾向がある。 </li><li>チャンバーは今灌流装置に接続し、約0.5ml /分で灌流、顕微鏡にマウントされています。ローラーポンプ出口ポートからチャンバーとオーバフローに生理食塩水フィードは、トラップと吸引ポンプにより除去される。ルース細胞と細胞外色素がチャンバーの灌流によって削除されるしながら準備は、少なくとも10分間暗所に残されている。温度安定性は、小さな変動が唯一の細胞のCa 2 +恒常性に影響しないことがありますので、決定的に重要であるだけでなく、染料のK d に影響を与える可能性があります。実験は通常25で行われる℃で、このレベルでは暗い部屋の温度を維持することによって達成した。我々は、必要なレベルで室温を維持する温度制御ステージまたは生理食塩水流入でサーモスタット制御のヒーターを使用するよりも高い温度とフォーカスの安定性を提供することを見出した。 </li><li>細胞は、対照的に（油浸40倍または60倍）目標とイメージングのためのエリアが選択されている相の下に表示されています。入口ポートの近くにあるポリ- D -リシン被覆面積の部分は、生理食塩水の流れが層流と一致しているところ、好ましい。細胞密度が適切である領域を使用することも重要です（過度の密度は、隣接するセルからの信号のピックアップを介してデータの品質と整合性に影響を与える）と細胞が適切に接続されていますが鞭毛の活動が目に見えるです。位相コントラスト画像が保存されます。顕微鏡、蛍光モード（励起480nmの、発光540nmの）に切り替えられると、露光時間は明確な蛍光画像を（通常は50から200ミリ秒）を取得するために必要な最小限に抑えています。 </li><li>実験は、時系列画像収集ソフトウエア（IQ）を活性化することによって開始されます。一般的に画像は、0.1 Hzで取得され、照明は、ソフト制を用いて画像取得の期間に限定されています制御シャッターを再。はるかに大きい画像取得レートを使用することができますが、引当金は、漂白し、細胞への光損傷に起因するアーチファクトの世代の問題（説明を参照）ごとに行う必要があります。 IQは（そして他のほとんどの買収のソフトウェアプラットフォーム）実験中に蛍光のリアルタイムのグラフ化が可能になります。 </li><li> 3-5分の持続時間の生理食塩水の成分の操作（そのような[Ca 2 +]のOなど）と薬物のアプリケーションの制御周期後に灌流ヘッダー内の生理食塩水の置換によって達成される。各刺激の加算の時間が記載されているので、撮影室に到着のその時は、ここで説明する、レスポンスが遅い（0.1 Hzでサンプリング）の評価のための十分な精度を提供する、計算することができます。より迅速な応答では高い精度は、ワーナーRC20室に設けられた第2流入ポートを介して生理食塩水の流れに直接刺激を加えることによって達成することができます。 </li><li>画像は、IQを使用してオフラインで分析されています。興味（ROIを）の領域は、各セルの周りに描かれている（または細胞の一部）と、セルの空き領域は、ソフトウェアによる自動バックグラウンド除去のために（選択されています。画像のシリーズは、先体反応を停止したか、受けた細胞を除去するためにチェックされている（その実験中）細胞質色素の損失が続く蛍光の大規模かつ急速な増加として表示され、時系列として解析するときにアーティファクトを引き起こすのに十分な動きを示したもの。 </li><li>時間の蛍光強度のシリーズは、各ROIのために取得され、これらのデータは、Excelでオフラインで分析されています。最初は蛍光は、式を使用して、制御期間中に得られた平均値に正規化されてR = [（FFの残り ）/ F 残り ] × 100％は、Rは制御周期に比べて蛍光の％の変化であるときは、F蛍光強度である時刻tとFの残りの部分は、制御期間中に得られたFの少なくとも30測定の平均です。 </li></ol>代表的な結果図1は、細胞を3μMのプロゲステロンで刺激した実験からの一連の画像を示しています。上段と映画1はグレースケールの蛍光画像と同じ魔術を示す（表の&#39;16_colorsルックアップ擬似カラーで（と映画では2）を以下に示す&quot;イメージJに）、ここで、&quot;クール&quot;色が低い蛍光強度を示し、 &quot;暖かい&quot;色が高い蛍光強度を示している。細胞は、IQのルックアップテーブルを用いて、実験中に擬似カラーで表示できますが、グレースケールを使用すると、一般的に評価するためのより有益です。細胞はよく標識かどうかをすることができます。最初の二つの画像は、0秒と100秒の録音を開始した後に採取した。蛍光が安定しており、後の先体領域と精子の首で最強になる傾向があります。プロゲステロンは、約175秒で撮影室に入り、3番目と4 番目の画像（180秒および220 s）は[Ca 2 +] iの（蛍光）セルの後部頭頸部領域に起因するの急速な増加を示しています。その後の画像は、初期の減衰を示し、290、360、740、990から1440秒にあり[Ca 2 +] iの一過性と二次持続的上昇の開発。図2は、正規化された蛍光の各ROI（制御周期に比べて蛍光の％の変化）のために生の蛍光値を変換し、スプレッドシートの分析を示す図3は、3μMのプロゲステロンに&quot;典型的な&quot;応答を示す3個の細胞のための時間正規化蛍光のプロットを示しています。 <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig1.jpg" alt="図1" /> プロゲステロンで刺激した細胞から図1の例のデータ。グレースケール（上段）と擬似カラー（下段）の蛍光画像のシリーズが表示されます。タイムポイントは0、180、220、290、360、990sです。 3μMのプロゲステロンは175秒で撮影室に入りましたROIは最初のパネルに表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig2.jpg" alt="図2" /> 図2 Excelでの単一細胞の蛍光のデータの分析。黒内の数値は、垂直に配置された蛍光データの時系列です。赤色の数字は（下）テキストで与えられた式を用いて得られる正規化されたデータです。グラフには、刺激により、小さな振動の遅い立ち上がりと続く一連の蛍光の一過性上昇を示し、この実験ではセル64の正規化蛍光リアルタイムプロットを示しています。 <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig3.jpg" alt="図3" /> 値を制御する点で％の変化として表現される3個々のセルについては、 図3。蛍光リアルタイムトレース、.. 3μMのプロゲステロンは、矢印でマークされた時に追加されました。破線で示すには、コントロールの蛍光を意味する。

<ol>
	<li>Haughland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , (2002).</li><li>Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroboscopic+illumination+using+light-emitting+diodes+reduces+phototoxicity+in+fluorescence+cell+imaging.">Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging.</a> Biotechniques. 41, 191-197 (2006).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

正常に実行する場合は、この手法により、ヒトの精子における自発的および誘導のCa 2 +シグナルの分布と動態の記録。レスポンスは、人間の精子が自分の自発的な刺激のCa 2 +シグナルの変動の多くを示すことができるので重要である細胞（最大200）の多数から得ることができる。成功したラベルと記録中の細胞の生存は、サンプルの品質に大きく依存しています。悪いサンプルは貧しいラベル付け、不良反応と細胞が録音中に死ぬ可能性を与える。 ヒト精子の写真損傷に非常に敏感であり、それゆえ我々は細胞の生存を最大化し、細胞死に起因するアーチファクトを最小限に抑えるために最低限必要な照度を（強度と露光時間の両方）を使用します。高感度カメラは、（低輝度照明の使用を許可する）カメラが弱い蛍光をピックアップするので大きなメリットです。裏面照射型、EM - CCDカメラは、非常に高価なのに、特に適しています。代わりに、励起フィルターとキセノンや水銀ランプを使用してのLED照明は、（また、細胞の生存（西垣ら、2006）が向上します。 フラは、UV光で励起する必要があるため、それがそれぞれの比率の2つの画像を撮影する必要があるので、私たちは、レシオメトリックイメージングの明白な利点にもかかわらず、フラ-2を使用しないでください。単一波長、可視光の染料、蛍光強度の正規化で得られたデータについては、主に細胞間の色素ローディングの違いのためではなく、個々のセル内の色素分布を補正し、これは留意する必要があります。単一波長の色素は、原則として、キャリブレーションすることができますが、技術の精度が悪く、我々はこれを行うにはしないでください。 さらにキャリブレーションなしフラ-2（または放出比染料インド）、、で得られた比のデータが[Ca 2 +] iの相対的な変化の許容忠実な表現を与えるのに対し、単一波長の色素の蛍光強度が直線的にはほど遠いです。の[Ca 2 +] iに関連して飽和曲線の最も有用な部分を介して単一波長の色素の関係は、通常、対数に近似している。我々は現在使用オレゴングリーンBAPTA - 1（図4）それは小さな変化に敏感であるための[Ca 2 +] iは近いレベルの（50 nM）を休憩する。するときの[Ca 2 +] iは1μMの応答は蛍光変化の観点から過少表現され、染料が飽和する可能性を超えて上昇。 UV励起に頼ることなく、技術の向上のためのオプションは、このようにみたFluo - 3、フラ赤などの染料でロードセルを2倍にすること。両方は、488 nmで励起が同時に彼らの反応は非常に異なっていることができます。 540と650 nmでの発光の記録は、[+のCa 2] iの（Haughland、2002）と精子（Nisigakiら、2006）に適用される可能性があるの正確なモニタリングのためのより良い方法を提供することができます比を提供します。 <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。オレゴングリーンBAPTA - 1およびオレゴングリーンBAPTA - 2用のフリーの[Ca 2 +]（nM）およびピーク波長（約525nmの）での蛍光発光との関係。 OGB1は〔Ca 2 +]が、より低いレベルで飽和し、その結果、より小さい使用可能な範囲を持って休んでより高い蛍光を示します。これらのプロットのデータは、Molecular Probes社ハンドブック（Haughland、2002）から得た。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Low light level Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QImaging</td>
<td>Rolera XR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oregon Green BAPTA-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>06807</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Andor</td>
<td>IQ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National Institues of Health</td>
<td>Image J</td>
<td>Public domain software</td>
</tr>
<tr>
<td>LED illumination system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cairn Research</td>
<td>Opto LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

techniques for imaging ca2+ signaling in human sperm

蛍光灯、Caでロードされた細胞の蛍光顕微鏡<sup&gt; 2 +</sup&gt;感受性色素Caの空間的および時間的な側面の測定に使用されます<sup&gt; 2 +</sup&gt;生細胞のシグナル。ここではCaでヒト精子の懸濁液をロードするための我々の研究室で使用される方法を説明します<sup&gt; 2 +</sup&gt; - 報告染料をして生理的刺激時の蛍光シグナルを測定する。運動性の細胞は、直接スイムアップで単離し、実験に応じて、0〜24時間capacitating条件下でインキュベートする。 Caの細胞透過性のAM（アセトキシメチルエステル）エステルの形<sup&gt; 2 +</sup&gt;報告の染料は、hが細胞質中に色素をロードするために許可されている細胞のアリコートと1の期間に追加されます。我々は、細胞への光ダメージを最小限に抑えるために、可視波長色素を使用していますが、これはレシオメトリック録音が可能ではないことを意味します。このアプローチの利点と欠点について説明されています。ロード期間の細胞中にイメージングチャンバーに導入し、ポリ- D -リジンコートしたカバースリップに付着させています。ロード期間の過剰の染料とバラセルの終了時に灌流装置にチャンバーの接続が削除されます。室が継続的に灌流され、刺激と変更されたSalinesのは、その後灌流ヘッダーに追加されます。実験は、蛍光画像の経時的買収によって記録され、手動で関心領域を描くことで、詳細をオフラインで分析されます。データは、各セル（またはセルの一部）、Caを示すグラフについては、そのような前刺激のレベルに正規化されています<sup&gt; 2 +</sup蛍光の％の変化に応じて&gt;応答が得られる。

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Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

刺激誘発の[Ca<sup&gt; 2 +</sup個々の人間の精子の&gt;] iの信号が評価されています。運動性の細胞は、カルシウムがロードされています<sup&gt; 2 +</sup&gt;感受性蛍光色素（AM -エステル法）とperfusableチャンバー内に固定化した。細胞は、タイムラプス蛍光顕微鏡で画像化し、灌流媒体を介して刺激されています。単一細胞（または地域）の応答は、Excelを使用してオフラインで分析されています。

イメージングカルシウムのためのテクニック 2 +人間の精子でシグナリング

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

techniques-for-imaging-ca2-signaling-in-human-sperm

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

17.0K ビュー.  University of Birmingham. 刺激誘発の[Ca 2 +] iの信号が評価されています。運動性の細胞は、カルシウムがロードされています 2 +感受性蛍光色素（AM -エステル法）とperfusableチャンバー内に固定化した。細胞は、タイムラプス蛍光顕微鏡で画像化し、灌流媒体を介して刺激されています。単一細胞（または地域）の応答は、Excelを使用し?...

ビデオ: Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

ハニービーの嗅覚学習中のキノコ体の神経細胞のイメージング- 生体内のCa 2 + の

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

生物学

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

蛍光その場で</emヒト精子の>ハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

血管のCaの可視化 2 +パラクリン派生ROSをきっかけにシグナリング

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

発現クローニングによりGrb2のシグナル伝達複合体を研究するために高コンテンツイメージングワークフロー

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

カルシウムの同時測定のための人間の心房筋細胞の分離<sup&gt; 2 +</sup&gt;過渡と膜電流

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

細胞内Ca測定<sup&gt; 2 +</sup4つの方法を使用して人間の精子で&gt;変更：従来の蛍光測定、停止フロー蛍光法、フローサイトメトリーおよび単一細胞イメージング

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

イメージングローカルCA<sup&gt; 2+</sup&gt;培養哺乳動物細胞内シグナル

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

細胞内カルシウムの二光子イメージング<sup&gt; 2+</sup&gt;取扱い及び内皮における一酸化窒素産生および単離されたラット大動脈の平滑筋細胞

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

固定における減数分裂Iのイメージング前中期および中期のための技術<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...