Les préadipocytes primaires sont un système expérimental précieux pour comprendre les voies moléculaires qui contrôlent le métabolisme des adipocytes. Les embryons de poulet offrent la possibilité d’isoler les préadipocytes dès le stade le plus précoce du développement des adipocytes. Cette méthode a été optimisée pour produire des cellules avec une viabilité élevée et une capacité accrue à se différencier en adipocytes matures, qui peuvent être utilisés pour l’analyse fonctionnelle de la croissance des graisses en début de vie et du développement embryonnaire chez les poussins.
Le processus de différenciation adipogénique est très comparable entre les poulets et les humains. Par conséquent, les préadipocytes isolés peuvent être utilisés comme modèle à double proposition pour des études pertinentes pour les humains et la volaille. Pour commencer, écouvillonnez le corps de l’embryon avec 70% d’éthanol.
Ensuite, pour éviter les interférences pendant la filtration à des étapes ultérieures après la digestion, frottez doucement la surface de la peau avec de la gaze stérile pour enlever les plumes. Ensuite, coupez la peau entre les jambes et la région abdominale pour révéler la paire de dépôts adipeux fémoraux. Utilisez une pince incurvée d’une main pour maintenir la peau autour de la jambe et enlever doucement la graisse sous-cutanée fémorale.
d’autre part. Plus tard, utilisez une pince incurvée pour éloigner doucement le dépôt de la jambe. Transférer les tissus dans un tube de 15 millilitres contenant cinq millilitres de milieux de collecte et répéter la dissection de l’autre côté du coussinet adipeux.
Maintenant, transférez les coussinets de graisse collectés dans une boîte de Petri de 60 millimètres contenant une solution de stérilisation et rincez brièvement en faisant tourbillonner le plat plusieurs fois. Rincez ensuite la solution de stérilisation en transférant les coussinets de graisse dans une boîte de Petri de 60 millimètres contenant du PBS. Faites tourbillonner doucement la plaque et une fois de plus, lavez avec DU PBS.
Pour la digestion des tissus adipeux, transférez-les dans un tube de 15 millimètres contenant une solution enzymatique préchauffée. Ensuite, immergez une paire de longs ciseaux droits dans le tube et enfin hachez les tissus adipeux de la solution en morceaux aussi petits que possible. Transférer le tissu haché et la solution enzymatique dans une fiole autoclavée de 25 millilitres.
Envelopper la fiole avec un film de paraffine et placer la fiole dans un incubateur à agitateur orbital à 37 degrés Celsius pour la digestion. Après la digestion, pipetter doucement de haut en bas pour bien mélanger. Ensuite, retirez tous les morceaux de tissu non digéré et de débris en filtrant à travers une passoire de tissu de 250 micromètres dans un tube de 15 millilitres par pipetage.
Maintenant, retirez les cellules adhérées à la fiole en rinçant la fiole avec quatre millilitres de milieu de croissance et filtrez la suspension cellulaire dans le même tube de 15 millilitres. Ensuite, rincez la passoire en pipetant à nouveau le milieu de croissance pour éliminer les cellules piégées dans le filtre. Centrifuger à 300 fois G pendant cinq minutes à température ambiante pour granuler la fraction cellulaire et aspirer le surnageant sans perturber la pastille cellulaire.
Remettez doucement la pastille dans un millilitre de tampon de lyse des globules rouges, mélangez bien par pipetage et incubez pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, diluez les cellules en ajoutant cinq millilitres de milieu de croissance au tube contenant les cellules et mélangez-les doucement par pipetage. Maintenant, pipetez les cellules sur une passoire à cellules de 40 micromètres et filtrez-les dans un nouveau tube de 50 millilitres.
Rincez ensuite la passoire avec cinq millilitres supplémentaires de milieu de croissance et abattez les cellules en centrifugant à 300 fois G pendant sept minutes à température ambiante. Aspirez soigneusement le surnageant. Remettre en suspension la pastille cellulaire restante dans un millilitre de milieu de croissance par pipetage Pour déterminer la densité et la viabilité de la cellule, mélanger 10 microlitres de chaque échantillon en bleu trypan par pipetage.
Chargez 10 microlitres du mélange sur l’hémocytomètre et comptez les cellules. L’analyse des préadipocytes après 24, 48 et 72 heures a montré une morphologie et un nombre cellulaires normaux. L’induction adipogénique des préadipocytes a montré une différenciation rapide et une accumulation de gouttelettes lipidiques.
La manipulation agressive des préadipocytes pendant l’isolement a entraîné des dommages cellulaires et un faible nombre de cellules. Une contamination microbienne peut être observée malgré la prise de mesures préventives. La coloration lipidique avec de l’huile rouge O a indiqué que les préadipocytes commencent rapidement à développer des gouttelettes lipidiques sous induction adipogène et que l’accumulation progresse au fil du temps, comme observé en 24, 48 et 72 heures.
L’accumulation de lipides par rapport au nombre de cellules a été quantifiée à l’aide de taches de lipides et d’ADN. L’accumulation de lipides et la prolifération cellulaire ont augmenté avec le temps. Un faible nombre de cellules ou de cellules endommagées peut être observé lorsque les fractions tissulaires sont digérées trop longtemps.
Par conséquent, il est recommandé de ne pas dépasser une heure et demie de digestion. Les préadipocytes isolés peuvent être utilisés pour les études d’expression génique. Un ARN suffisant peut être obtenu pour une utilisation dans la synthèse de l’ADNc et la qPCR ou l’ARNiq de suivi.
