该协议提供了一种可重复的肺炎模型，可产生稳健的急性肺损伤。该模型的其他优点是可用于在小鼠中重现传染性ARDS或急性呼吸窘迫综合征。正如我所提到的，该模型具有高度的可重复性，其中可以很容易地滴定死亡率和损伤水平，以评估急性肺损伤的早期和晚期阶段和消退情况，从而作为评估治疗策略的平台。
尽管该协议没有提供诊断或治疗肺损伤的新方法，但它是一种可靠的模型，可以测试新疗法，这对于与免疫学、肺部疾病和传染病相关的领域特别有用。该技术的优点之一是其可重复性。但是，首次使用这种技术的人可能会在气管内插入导管时遇到困难。
这就是为什么理想情况下，学习这种技术的人应该开始在安乐死的动物身上练习。首先，在加热的振荡器或培养箱中将血琼脂板在 37 摄氏度下加热 10 分钟。从冰箱中取出一个新的细菌储备瓶，在 37 摄氏度的水浴中轻轻搅拌解冻，直到小瓶完全解冻。
避免用温水接触 O 形圈或盖子。要手动计数平板上的细菌菌落，请进行 1 次 10 到六分之一的稀释，并在预热的血琼脂平板上从最后一次稀释开始铺板 200 微升。将板在 37 摄氏度下孵育过夜。
第二天，通过应用给定的公式确定新的细菌浓度。将麻醉的小鼠放在干净且消毒的表面上。将鼠标挂在门牙上，然后轻轻地用胶带粘住前肢。
剃除颈部区域并用氯己定和 70% 酒精消毒该区域。然后使用手术剪刀，在颈部浅中线切口做一个一厘米的浅中线切口，以观察气管。如果看到大量的脂肪组织，请小心地垂直解剖脂肪组织，以观察气管。
轻轻地将舌头向外拉，将一根 20 号的血管导管插入口腔，将导管推进气管。在气管上轻轻按压，以利于插管。插管后，将鼠标连接到呼吸器以确认插管。
将呼吸机参数设置为 200 微升潮气量和每分钟 200 次冲程。确认插管后，断开鼠标与呼吸器的连接，并使用 200 微升移液管凝胶加载吸头小心地通过血管导管滴入 50 微升细菌制剂。安装后，再次将鼠标连接到呼吸器以帮助重新开始呼吸。
将鼠标放在呼吸器上 30 到 60 秒以监测呼吸。如果观察到呼吸缓慢，请再次将鼠标连接到呼吸器。通过在皮肤上滴一滴胶水来闭合切口。
将皮肤褶皱合拢，轻轻按压，直到胶水变干。将安乐死的小鼠仰卧在干净的手术板上，并将其挂在门牙上。用70%乙醇喷洒小鼠皮肤后，使用剪刀进行一个小的浅表中线颈部切除术，以观察气管。
用 20 号导管插管气管，并使用 1 毫升注射器小心地在气管内加入 1 毫升无钙 PBS。让肺完全扩张，然后使用同一注射器吸出液体。重复该过程两次，总共 2 毫升。
将支气管肺泡灌洗液（BAL）转移到 2 毫升等分试样中。用剪刀打开胸腔，露出肺、心脏和气管。小心地解剖横膈膜并取下肋骨架，确保不要夹到肺组织。
横断腹主动脉以允许放血。使用剪刀在右心室做一个约 1 至 2 毫米的小切口，并使用 20 号导管注射 5 毫升冷 PBS，灌注肺组织。成功灌注后，肺组织变白苍白，PBS通过腹主动脉离开血管内隔室。
然后小心地取出肺并将其从气管中解剖出来。或者，如果肺用于组织学检查，请小心地插入一根 20 号导管，用福尔马林溶液将肺部充气至 25 厘米。一旦肺部被吹气，将一根长约 5 厘米的 3/O 缝合线穿过气管下方，并将其牢固地系住两次，以确保福尔马林留在肺组织中。
轻轻地将肺与其他组织解剖，并将其放入含有 10 毫升福尔马林溶液的 15 毫升锥形管中。将 BAL 在 4 摄氏度下以 500 G 离心 5 分钟，然后在单独的管中除去无细胞上清液。通过加入 100 微升裂解缓冲液一分钟来裂解红细胞。
通过加入一毫升PBS中和裂解反应。离心 BAL，并除去上清液，然后将沉淀重新悬浮于 100 至 300 微升 PBS 中。接下来，通过自动细胞计数用 0.4% 台盼蓝染色剂进行细胞计数。
在含有 5 毫升冷 PBS 的 15 毫升锥形管中轻轻地从组织中解剖肺。解剖后，从PBS中取出肺并用纸巾擦干。从也已摘除的其他组织（如气管）中解剖右肺和左肺。
按照文本手稿中的描述准备消化鸡尾酒，并将肺转移到含有一毫升消化鸡尾酒的 C 管中。将试管转移到组织解离器中，并按照标准化方案处理肺组织。解离后，将 10 毫升冷 PBS 加入管中并适当混合。
在冰上的50毫升锥形管上使用70微米细胞过滤器过滤单细胞悬浮液。离心悬浮液并除去上清液。在室温下加入 1 mm 裂解缓冲液 1 分钟。
然后加入 10 毫升冷 PBS 以停止裂解反应并除去上清液。将细胞重新悬浮在PBS中，并通过自动细胞计数用台盼蓝染色剂进行细胞计数。在细菌性肺炎诱导的小鼠肺损伤后，与未感染的对照组相比，感染组的体重更轻。
肺炎链球菌或Spn组的体重在接近基线时恢复，而肺炎克雷伯菌或Kpn感染的小鼠在感染六天后恢复缓慢。感染组的BAL蛋白浓度以及BAL和肺的总细胞计数均明显较高。在接种后第二天、第四天和第六天获得显示两种模型中炎症过程的代表性组织学切片，显示 Kpn 感染小鼠持续肺泡炎症的证据，即使在第 10 天也是如此。
Kpn感染的小鼠在第10天继续损伤，而Spn感染的小鼠在第6天解决了肺部炎症。通过多色流式细胞术观察 Spn 感染 6 天后的免疫细胞景观显示粒细胞、间质巨噬细胞、单核细胞、B 细胞和 T 细胞（包括自然杀伤细胞）数量增加。在尝试这种方法时，插入导管是造成可复制感染的关键。
这是一种可靠的方法，可作为确定急性肺损伤研究和解决靶点的平台。
