يوفر هذا البروتوكول نموذجا قابلا للتكرار للالتهاب الرئوي الذي يولد إصابة قوية وحادة في الرئة. المزايا الأخرى لهذا النموذج يمكن استخدامها لإعادة إنتاج متلازمة الضائقة التنفسية الحادة المعدية أو متلازمة الضائقة التنفسية الحادة في الفئران. كما ذكرت ، فإن هذا النموذج قابل للتكرار بدرجة كبيرة حيث يمكن معايرة مستوى الوفيات والإصابات بسهولة لتقييم المراحل المبكرة والمتأخرة من إصابة الرئة الحادة وحلها ، والتي تعمل كمنصة لتقييم الاستراتيجيات العلاجية.
على الرغم من أن هذا البروتوكول لا يوفر نهجا جديدا لتشخيص أو علاج إصابة الرئة ، إلا أنه نموذج موثوق به حيث يمكن اختبار علاجات جديدة ، وهو أمر مفيد بشكل خاص للمجالات المتعلقة بالمناعة والأمراض الرئوية والأمراض المعدية. واحدة من مزايا هذه التقنية هي استنساخها. ومع ذلك ، قد يواجه الأشخاص الذين يقومون بهذه التقنية لأول مرة صعوبات في إدخال القسطرة داخل القصبة الهوائية.
هذا هو السبب في أنه من الناحية المثالية ، يجب أن يبدأ الأشخاص الذين يتعلمون هذه التقنية في ممارسة الرحيم. للبدء ، قم بتسخين صفيحة أجار الدم لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في شاكر ساخن أو حاضنة. خذ قارورة مخزون بكتيرية جديدة من الفريزر وقم بإذابتها عن طريق التقليب اللطيف في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية حتى تذوب القارورة تماما.
تجنب لمس الحلقة O أو الغطاء بالماء الدافئ. لحساب المستعمرات البكتيرية يدويا على طبق ، قم بإجراء تخفيف 1 مرة من 10 إلى السادس ولوحة 200 ميكرولتر من التخفيف الأخير على صفيحة أجار الدم الدافئة مسبقا. احتضان اللوحة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
في اليوم التالي ، حدد تركيز البكتيريا الجديد عن طريق تطبيق الصيغة المحددة. ضع الماوس المخدر على سطح نظيف ومعقم. شنق الماوس من القواطع والشريط برفق forelimbs.
حلق منطقة الرقبة وتطهير المنطقة بالكلورهيكسيدين و 70٪ كحول. ثم باستخدام المقص الجراحي ، قم بعمل شق رقبة سطحي وسطي بسنتيمتر واحد لتصور القصبة الهوائية. إذا شوهدت وفرة من الأنسجة الدهنية ، فقم بتشريح الأنسجة الدهنية عموديا بعناية لتصور القصبة الهوائية.
اسحب اللسان للخارج برفق وأدخل قسطرة وعائية قياس 20 عبر الفم ، مع دفع القسطرة إلى القصبة الهوائية. ضع ضغطا لطيفا على القصبة الهوائية لتسهيل التنبيب. بعد التنبيب ، قم بتوصيل الماوس بجهاز تنفس لتأكيد التنبيب.
اضبط معلمات جهاز التنفس الصناعي على 200 ميكرولتر من حجم المد والجزر و 200 ضربة في الدقيقة. بعد التأكد من التنبيب ، افصل الماوس عن جهاز التنفس الصناعي وغرس بعناية 50 ميكرولترا من العامل البكتيري من خلال قسطرة الأوعية الدموية باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ، طرف تحميل هلام. بعد التثبيت ، قم بتوصيل الماوس بجهاز التنفس الصناعي مرة أخرى للمساعدة في إعادة تشغيل التنفس.
اترك الماوس على جهاز التنفس الصناعي لمدة 30 إلى 60 ثانية لمراقبة التنفس. إذا لوحظ نمط التنفس البطيء ، فقم بتوصيل الماوس بجهاز التنفس الصناعي مرة أخرى. أغلق الشق بإضافة قطرة واحدة من الغراء إلى الجلد.
اجمع طيات الجلد معا واضغط برفق حتى يجف الغراء. ضع الفأر الرحيم على لوح جراحي نظيف وعلقه بواسطة القواطع. بعد رش جلد الفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول ، باستخدام المقص ، قم بإجراء استئصال صغير وسطحي للرقبة في خط الوسط لتصور القصبة الهوائية.
قم بتقليب القصبة الهوائية باستخدام قسطرة قياس 20 وأضف بعناية ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني خال من الكالسيوم داخل القصبة الهوائية باستخدام حقنة سعة ملليلتر واحد. اسمح بتوسيع الرئة بالكامل ، ثم استنشاق السائل باستخدام نفس المحقنة. كرر الإجراء مرتين لما مجموعه ملليلتر.
نقل غسل القصبات الهوائية ، أو BAL ، إلى حصلة 2 ملليلتر. باستخدام المقص ، افتح التجويف الصدري لفضح الرئة والقلب والقصبة الهوائية. تشريح الحجاب الحاجز بعناية وإزالة القفص الصدري لضمان عدم قرصة أنسجة الرئة.
عبر الشريان الأورطي البطني للسماح بالاستنزاف. قم بإفساد أنسجة الرئة عن طريق إجراء شق صغير من حوالي واحد إلى ملليمترين في البطين الأيمن باستخدام المقص وحقن خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني بارد ، باستخدام قسطرة قياس 20. عند التروية الناجحة ، تتحول أنسجة الرئة إلى اللون الأبيض والشاحب ، ويترك برنامج تلفزيوني المقصورة داخل الأوعية الدموية عبر الشريان الأورطي البطني.
ثم استخراج الرئة بعناية وتشريحها من القصبة الهوائية. بدلا من ذلك ، إذا تم استخدام الرئة في الأنسجة ، فقم بإدخال قسطرة قياس 20 بعناية لتضخيم الرئتين حتى 25 سم بمحلول الفورمالين. بمجرد نفخ الرئتين ، مرر خيطا خيطا يبلغ طوله حوالي خمسة سنتيمترات تحت القصبة الهوائية واربطه بإحكام مرتين لضمان بقاء الفورمالين في أنسجة الرئة.
تشريح الرئة بلطف من بقية الأنسجة ووضعها في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من محلول الفورمالين. أجهزة الطرد المركزي BAL عند 500 G عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق وإزالة المادة الطافية الخالية من الخلايا في أنبوب منفصل. تحلل خلايا الدم الحمراء عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل لمدة دقيقة واحدة.
تحييد تفاعل lysing عن طريق إضافة ملليلتر واحد من PBS. أجهزة الطرد المركزي BAL ، وإزالة المادة الطافية قبل إعادة تعليق الحبيبات في 100 إلى 300 ميكرولتر من PBS. بعد ذلك ، قم بإجراء عدد الخلايا باستخدام 0.4٪ من صبغة تريبان الزرقاء عن طريق عد الخلايا تلقائيا.
تشريح الرئة بلطف من الأنسجة في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني بارد. بعد التشريح ، قم بإزالة الرئة من برنامج تلفزيوني وجففها باستخدام منشفة ورقية. تشريح الرئة اليمنى واليسرى من الأنسجة الأخرى التي تم استخراجها أيضا مثل القصبة الهوائية.
قم بإعداد كوكتيل هضم كما هو موضح في المخطوطة النصية وانقل الرئة إلى أنبوب C يحتوي على ملليلتر واحد من كوكتيل الهضم. انقل الأنبوب إلى مفكك الأنسجة واتبع البروتوكول القياسي لمعالجة أنسجة الرئة. بعد التفكك ، أضف 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني بارد في الأنبوب واخلطه بشكل صحيح.
قم بتصفية التعليق أحادي الخلية باستخدام مصفاة خلية 70 ميكرون فوق أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر على الجليد. أجهزة الطرد المركزي التعليق وإزالة طاف. أضف ملليمترا واحدا من محلول التحلل لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
ثم أضف 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني بارد لإيقاف تفاعل التحلل وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني وقم بإجراء عدد الخلايا باستخدام صبغة تريبان الزرقاء عن طريق العد الآلي للخلايا. بعد إصابة الرئة الناجمة عن الالتهاب الرئوي البكتيري في الفئران ، أظهرت المجموعات المصابة وزنا أقل للجسم مقارنة بالسيطرة غير المصابة.
استعادت مجموعة العقدية الرئوية أو Spn وزن الجسم نحو خط الأساس بينما أظهرت Klebsiella pneumoniae ، أو الفئران المصابة ب Kpn تعافيا بطيئا بعد ستة أيام من الإصابة. كان تركيز بروتين BAL وعدد الخلايا الإجمالي لكل من BAL والرئتين أعلى بشكل ملحوظ في المجموعات المصابة. تم الحصول على أقسام نسيجية تمثيلية تعرض العملية الالتهابية في كلا النموذجين في اليوم الثاني والرابع والسادس بعد التلقيح تظهر دليلا على استمرار الالتهاب السنخي في الفئران المصابة ب Kpn ، حتى في اليوم 10.
واصلت الفئران المصابة ب Kpn الإصابة بحلول اليوم 10 بينما حلت الفئران المصابة ب Spn التهاب الرئة بحلول اليوم السادس. أظهر مشهد الخلايا المناعية عن طريق قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان بعد ستة أيام من الإصابة ب Spn عددا متزايدا من الخلايا المحببة والبلاعم الخلالية والوحيدات والخلايا البائية والخلايا التائية ، بما في ذلك الخلايا القاتلة الطبيعية. أثناء محاولة هذه الطريقة ، فإن إدخال القسطرة هو المفتاح للإصابة بالتهابات قابلة للتكاثر.
هذه طريقة موثوقة تعمل كمنصة لتحديد الأهداف لدراسة إصابة الرئة الحادة وحلها.
