私たちのプロトコルは、心臓胸部手術のための思春期前のマウスの子犬の麻酔と気管内挿管のための最初の文書化された方法です。私たちは、動物の死亡率を最小限に抑えながら、心臓胸部手術のために10 =日齢のC57ブラックシックスJマウスの子犬の気管内挿管を可能にする麻酔レジメン、特殊な機器、および特定の取り扱い方法を開発しました。成人挿管の経験があるオペレーターは、7〜8匹の子犬の10リットルで練習した後、思春期前の挿管に習熟できると予想しています 手順を実演するのは、私たちの研究室の上級スタッフサイエンティストであるJianxin Wu博士です。
実験当日は、原稿に記載されているように、10日齢の仔の挿管用の専用機器を設置します。手術には、21ミリメートルのプラスチック製メスルアーロックアダプターに取り付けられた長さ19ミリメートルのプラスチックチューブで構成されるカニューレを使用します。ルアーロックアダプターを介して銅線を挿入して、カニューレのチューブを硬化させます。
麻酔をかけた子犬を仰臥位で挿管プラットフォームに固定します。麻酔をかけた子犬を挿管する前に、足のピンチ反射で麻酔の深さを確認してください。足のピンチ反射は存在しなければなりませんが、意識のある動物のそれより著しく減少しています。
小さな鉗子で子犬の舌を持ち、銅線と柔軟な光ファイバーライトで作られた喉頭鏡を使用して、声門と声帯を露出させます。ルアーロックの端が先端よりわずかに低くなるように硬化したカニューレを傾け、声帯が分離したらすぐにカニューレを挿入し、ルアーロックアダプターが口のすぐ外になるまで進めます。その後、すぐにワイヤーを取り外します。
挿管後の麻酔の深さを、動物が自発的に呼吸する能力によって評価する。挿管した子犬を摂氏37度に設定された加温パッドに移します。自発呼吸の子犬の気管挿管が成功したことを確認するために、挿管カテーテルを短時間ブロックして、胸の動きを防ぐことを確認します。
気管内カニューレを人工呼吸器に接続し、毎分1リットルの流量で100%酸素を供給します。再呼吸を最小限に抑えるために、手順は15秒未満で完了します。手術用の手術用麻酔を誘導した後、胸壁の動きの頻度が人工呼吸器の頻度と等しいことを確認し、気管挿管を確認します。
心筋梗塞手術のために10倍と16倍の対物レンズを備えた手術用顕微鏡の下に子犬を置きます。皮膚を消毒した後、メスを使用して胸の左側壁の3番目と4番目の肋骨の間に水平方向の皮膚切開を行います。細かい鉗子の助けを借りて、肋間腔内の鈍い解剖によって胸部を開き、開創器を使用して空間を開いたままにします。
左冠状動脈遠位から左心房付属器まで9-0ポリプロピレンモノフィラメント縫合糸で結紮することにより、心筋梗塞を誘発します。梗塞手術の10分後、7-0縫合糸で皮膚を閉じます。70%エタノールまたは生理食塩水で血液をきれいにし、ベタジンで切開部を消毒します。
動物が回復し、数分以内に自発呼吸が再開することを確認します。次に、子犬を温めた酸素処理チャンバーに戻し、回復中継続的に監視します。正しい反射が回復したら、子犬を抜管します。
ホームケージの寝具で子犬をそっとこすります。子犬を暖かく保ち、呼吸が規則的であり、子犬が自発的に動くことができることを確認します。ダムをケージに戻します。
次に、麻酔から完全に回復したら、すべての子犬を返します。摂氏37度に設定された保温パッドに半分置いたケージにダムと子犬を一晩収容します。術後3日目に、尾をテーピングして、麻酔をかけた子犬を温暖化パッドの仰臥位に固定します。
切歯の上に糸を置き、子犬を所定の位置にテープで固定し、頭をノーズコーンに伸ばしたままにします。70%エタノールで皮膚を消毒します。細かいハサミを使用して、気管に沿って右総頸動脈上の皮膚を1センチメートル切開し、26ゲージの針に取り付けられた単一のルーメンポリエチレンチューブを使用して露出した血管をカニューレ挿入し、原稿に記載されているように心停止を引き起こした後、0.2ミリリットルのヘパリン化生理食塩水を1分間投与します。 前の切開部から右頸静脈を解剖し、それを横断します。
心臓に0.2ミリリットルのPBSを灌流し、次に0.1ミリリットルの0.2%アルシアンブルーで灌流して、梗塞していない遠隔心筋を染色します。血液、PBS、次に頸静脈を介したアルシアンブルーの洗い流しによって証明される灌流の成功を確認します。完了したら、胸部を開き、周囲の結合組織と血管を解剖して心臓を解放して心臓を切除します。
心臓をPBSですすぎ、心房を取り除き、10倍の主観を使用して手術用顕微鏡に取り付けられたカメラで心臓を撮影します。予備実験では、麻酔レジメンは10日齢の子犬に最適化されました。ケタミン1kgあたり50ミリグラム、キシラジン1kgあたり6ミリグラム、およびアトロピン1kgあたり0.18ミリグラムの用量は、体重5.5〜7.30グラムの自発呼吸の子犬の気管内挿管を可能にするのに十分な麻酔深度をもたらした。
軽い子犬は高用量の麻酔に耐えられなかったため、投与量を30ミリグラム/kgのケタミン、4ミリグラム/kgのキシラジン、および0.12ミリグラム/kgのアトロピンに減らすことで、体重4.50〜5.49グラムの子犬の挿管が可能になりました。比較すると、ケタミンの投与量をkgあたり20ミリグラムにさらに減らすことで、体重3.15〜4.49グラムの子犬の挿管が可能になりました。この表には、手術に進んだ挿管された子犬の数と割合も示されています。
体重の低い子犬は、重い子犬よりも挿管が難しく、より多くの試行を必要としたため、体重が最も高いグループよりも子犬の生存率が低かった。また,低体重・中体重群よりも高体重群から挿管された仔が心筋梗塞手術に進んだ回数が多かった。心筋梗塞手術後の2日間の生存率は、86%〜92%の異なる体重群間で一貫していました麻酔の深さは挿管と生存にとって重要です。
麻酔が軽すぎると挿管が難しくなります。深すぎると、挿管中または挿管後に子犬が自発的に呼吸を停止します。私たちの麻酔挿管プロトコルにより、心臓胸部手術を必要とするモデルを思春期前のマウスで確立することができ、たとえば、この期間中の肺、食道、心臓の研究が可能になります。
