Наш протокол является первым документированным методом анестезии и эндотрахеальной интубации предподростковых мышиных щенков для кардиоторакальной хирургии. Мы разработали схемы анестезии, специализированное оборудование и специальные методы обработки, которые позволяют эндотрахеальную интубацию 10-дневных детенышей мыши C57 Black Six J для кардиоторакальной хирургии при минимизации смертности животных. Мы ожидаем, что оператор, имеющий опыт интубации у взрослых, может достичь мастерства в предподростковой интубации после практики на 10 пометах по семь-восемь детенышей Демонстрацией процедуры будет доктор Цзяньсинь Ву, старший научный сотрудник нашей лаборатории.
В день эксперимента установили специализированное оборудование для интубации 10-дневных детенышей, как описано в рукописи. Для операции используйте канюлю, состоящую из пластиковой трубки длиной 19 миллиметров, прикрепленной к 21-миллиметровому пластиковому адаптеру для фиксации женской приманки. Укрепите трубку канюли, вставив кусок медной проволоки через адаптер блокировки приманки.
Закрепите обезболенного щенка лежа на платформе интубации. Перед интубированием обезболенного щенка проверьте глубину анестезии по рефлексу защемления лапы. Рефлекс защемления лапы должен присутствовать, но заметно снижен по сравнению с рефлексом сознательного животного.
Держите язык щенка небольшими щипцами и используйте ларингоскоп, сделанный из куска медной проволоки и гибкого волоконно-оптического света, чтобы обнажить голосовую щель и голосовые связки. Наклоните застывшую канюлю так, чтобы конец замка приманки был немного ниже кончика, и как только голосовые связки отделятся, вставьте канюлю и вперед до тех пор, пока адаптер замка приманки не окажется прямо за пределами рта. Затем сразу же снимите проволоку.
Оцените глубину анестезии после интубации по способности животного дышать спонтанно. Перенесите интубированного щенка на согревающую прокладку, установленную при 37 градусах Цельсия. Подтвердите успешную интубацию трахеи спонтанно дышащего щенка, ненадолго заблокировав интубационный катетер, чтобы проверить, что это предотвращает движение грудной клетки.
Подключите эндотрахеальную канюлю к вентилятору, доставляя 100% кислород со скоростью потока один литр в минуту. Процедура должна занять менее 15 секунд, чтобы свести к минимуму повторное дыхание. После индуцирования хирургической плоскости анестезии для операции подтвердите интубацию трахеи, проверив, что частота движения грудной стенки равна частоте движения стенки грудной клетки.
Поместите щенка под хирургический микроскоп с объективами 10X и 16X для операции по инфаркту миокарда. После дезинфекции кожи сделайте горизонтальный кожный разрез между третьим и четвертым ребром в левой боковой стенке грудной клетки с помощью скальпеля. С помощью тонких щипцов откройте грудную клетку тупым рассечением межреберного пространства и используйте втягиватель, чтобы сохранить пространство открытым.
Индуцировать инфаркт миокарда путем перевязки левой коронарной артерии дистально к придатку левого предсердия с помощью 9-0 полипропиленового монофиламентного шва. После 10 минут операции инфаркта закройте кожу швом 7-0. Очистите кровь 70% этанолом или физиологическим раствором и продезинфицируйте разрез бетадином.
Дайте животному восстановиться и обеспечьте спонтанное дыхание в течение нескольких минут. Затем верните щенка в нагретую предварительно насыщенную кислородом камеру и постоянно контролируйте во время восстановления. По мере восстановления корректирующего рефлекса экстубируйте щенка.
Аккуратно потрите щенка домашней подстилкой в клетке. Держите щенка в тепле и убедитесь, что дыхание регулярное, а щенок способен к спонтанному движению. Верните плотину в клетку.
Затем возвращают всех детенышей, когда они полностью восстановятся после анестезии. Разместите плотину и щенков на ночь в клетке, помещенной наполовину на согревающую площадку, установленную при температуре 37 градусов по Цельсию. На третий день после операции закрепите обезболенного щенка в положении лежа на спине на согревающей подушке, заклеив хвост.
Поместите нить на резцы и заклейте щенка в положение и держите голову вытянутой в носовой конус. Дезинфицируйте кожу 70% этанолом. Используя тонкие ножницы, сделайте разрез в один сантиметр в коже над правой общей сонной артерией вдоль трахеи и каннулируйте открытый сосуд с помощью полиэтиленовой трубки с одним просветом, прикрепленной к игле 26 калибра, чтобы ввести 0,2 миллилитра гепаринизированного физиологического раствора в течение одной минуты после остановки сердца, как описано в рукописи, рассекните правую яремную вену через предыдущий разрез и переремонтируйте ее.
Перфьюзируйте сердце 0,2 миллилитра PBS, а затем 0,1 миллилитра 0,2% Alcian Blue, чтобы окрасить неинфарктный удаленный миокард. Проверьте успешную перфузию, о чем свидетельствует вымывание крови, PBS, а затем Alcian Blue через яремную вену. Когда это будет сделано, откройте грудную клетку и иссекните сердце, рассекая окружающую соединительную ткань и сосуды, чтобы освободить сердце.
Промыть сердце в PBS, затем удалить предсердия и сфотографировать сердце с помощью камеры, установленной на хирургическом микроскопе, используя 10-кратный субъективный. В предварительных экспериментах режим анестезии был оптимизирован для 10-дневных щенков. Доза 50 миллиграммов на кг кетамина, шесть миллиграммов на кг ксилазина и 0,18 миллиграмма на кг атропина привела к достаточной глубине анестезии, чтобы обеспечить эндотрахеальную интубацию спонтанно дышащих детенышей весом от 5,5 до 7,30 граммов.
Поскольку более легкие щенки не могли переносить более высокую дозу анестезии, снижение дозировки до 30 миллиграммов на кг кетамина, четырех миллиграммов на кг ксилазина и 0,12 миллиграмма на кг атропина позволило интубировать детенышей весом от 4,50 до 5,49 грамма. Для сравнения, дальнейшее снижение дозы кетамина до 20 миллиграммов на кг позволило интубировать детенышей весом от 3,15 до 4,49 грамма. В таблице также показано количество и процент интубированных щенков, которые приступили к операции.
Детенышей с более низкой массой тела было труднее интубировать, чем более тяжелых детенышей, и требовалось больше попыток, что привело к меньшему проценту выживания щенков, чем группа с самым высоким весом. Более того, большее количество интубированных щенков из группы с наибольшим весом перешло к операции по инфаркту миокарда, чем группа с низким и средним весом. Выживаемость через два дня после операции по инфаркту миокарда была последовательной между различными группами веса на уровне от 86% до 92% Глубина анестезии имеет решающее значение для интубации и выживания.
Если анестезия слишком легкая, интубация затруднена. Если они слишком глубокие, детеныши перестанут дышать спонтанно во время или после интубации. Наш протокол интубации анестезии позволит установить модели, требующие сердечной торакальной хирургии, у предподростковых мышей, что позволит, например, проводить исследования на легких, пищеводе и сердце в этот период.
